灰霉病處理紅顏草莓果實(shí)后相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析

楊戎戈李梓薇黃林源王晶晶趙林林尹景偉羊曄王靜文張艷

(1.江蘇省水文水資源勘測(cè)局揚(yáng)州分局，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué)/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州文水科技咨詢有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225000)

引言

草莓為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生常綠草本植物，草莓因外觀美觀，口感鮮嫩多汁，有“水果皇后”“水果牛奶”之美譽(yù)[1]，其含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素B1、維生素B2、維生素C，每100g新鮮果實(shí)里約含有60mg維生素C，以及有機(jī)酸如水楊酸、檸檬酸。草莓還含有草莓胺，具有很好的藥用價(jià)值。中國的草莓野生資源豐富程度世界排行第1，生產(chǎn)面積最大[2]。本試驗(yàn)選用“紅顏”草莓品種，由日本引進(jìn)，果實(shí)形狀為長圓錐形，此品種休眠淺，產(chǎn)量相對(duì)較大。

灰霉病是草莓生長成熟及采收貯藏中極易發(fā)生病害之一。草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea.)引起的病害，主要為害草莓葉片、莖、花以及果實(shí)部分，也對(duì)年產(chǎn)量和草莓的外觀品質(zhì)影響嚴(yán)重[3]?；移咸焰呔哂猩L繁殖迅速，易抗藥，在0℃以下依然繁殖的特點(diǎn)[4，5]。本試驗(yàn)過程中，感染灰霉病的草莓果實(shí)果肉變軟逐漸腐爛，果實(shí)表面生出灰褐色霉?fàn)畎唿c(diǎn)，未成熟的果實(shí)病變時(shí)，草莓果實(shí)會(huì)顯現(xiàn)出淡褐色干枯病斑，轉(zhuǎn)至呈干腐狀[6]。草莓生產(chǎn)過程中，此病菌普遍發(fā)生于果實(shí)轉(zhuǎn)色期到果實(shí)成熟期，12個(gè)月可危害30%～80%，病情逐漸嚴(yán)重[7]，后期為害嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致草莓減產(chǎn)10%～50%[6-8]。此病菌不經(jīng)控制會(huì)對(duì)草莓栽培造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)分析旨在于防治灰霉病的方法，篩選優(yōu)良抗病的草莓品種，為未來抗病基因研究鋪設(shè)道路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

草莓的品種豐富，本試驗(yàn)挑選八倍體草莓品種“紅顏”(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)作為試驗(yàn)材料。2016年11月27日—12月24日，于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院北校區(qū)連棟溫室大棚內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，大棚內(nèi)白天溫度在13～21℃，夜間溫度在9～15℃。此期間，草莓生長狀態(tài)良好，無病蟲危害。

灰霉菌的培養(yǎng)方法：所用灰霉菌(Botrytis cinerea)由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝系試驗(yàn)田所得。使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)為病菌培養(yǎng)基。

在PDA培養(yǎng)基上接種用常規(guī)方法純化后的灰霉菌，放入恒溫箱培養(yǎng)14d(25℃)。處理果實(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)上切下并放入裝有至少100mL無菌水的錐形瓶中，打開2個(gè)灰霉病培養(yǎng)基，將錐形瓶中的無菌水分別均勻倒入2個(gè)培養(yǎng)基中。用玻璃棒輕輕刮蹭培養(yǎng)基表面的灰霉菌核。將菌液倒入錐形瓶中。將培養(yǎng)基戳碎，倒入錐形瓶中。用干凈的塑料紙封住瓶口，皮筋扣住。將菌液放在震蕩器搖床上震蕩10min。用4層紗布過濾，顯微鏡鏡檢調(diào)整，制備懸浮液(孢子懸浮濃度為1×105cfu·mL-1)，用于接種果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰霉菌處理對(duì)不同發(fā)育時(shí)期草莓果實(shí)的影響

2016年12月26日于植物組織培養(yǎng)母液配制室內(nèi)做試驗(yàn)，每組分別有紅、白、青3種顏色的草莓。器材：紙，玻璃瓶或培養(yǎng)皿，針，酒精燈，菌液(灰霉病)，刷子，噴壺。在每個(gè)玻璃瓶底部墊上大小合適的紙，用噴壺將紙噴濕，不要過濕。將針在酒精燈上滅菌后，在每個(gè)草莓的不同部位上戳2個(gè)洞(不用刺穿)。此時(shí)選用不同發(fā)育時(shí)期的草莓果實(shí)，果實(shí)表皮顏色分別紅、白、青3種。每個(gè)草莓戳洞后刷上灰霉病菌液，放入玻璃瓶中。做完4組后，加1組沒有刷菌液與戳洞的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每組草莓中各有1個(gè)紅、白、青草莓果實(shí)。放置在植物組織培養(yǎng)母液配制室內(nèi)，每天觀察是否發(fā)病，相同時(shí)間段刷一次菌液，等待發(fā)病取照。

2016年12月31日發(fā)現(xiàn)草莓發(fā)病，給草莓拍照，照片清晰，分組明確。在凝膠成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。佩戴好一次性手套，用小刀將草莓表面的籽粒和表皮仔細(xì)清除，剪裁大小正好的錫紙，將去了籽粒的草莓用刀片切成薄片狀，用錫紙把草莓薄片包裹好。倒出部分液氮在泡沫盒內(nèi)，把錫紙包裹的草莓切片放入液氮(1個(gè)草莓用1個(gè)錫紙包裹，完成后立即放入液氮)。標(biāo)好姓名、組數(shù)、班級(jí)。從液氮中取出草莓錫紙，放入塑料袋中，放進(jìn)超低溫冰箱。

1.2.2 草莓果實(shí)RNA的提取

洗刷研缽研杵后放入滅菌鍋滅菌2h，在研缽中倒入適量液氮進(jìn)行預(yù)冷，從-80℃冰箱中取出植物組織樣品，在確保樣品不潮濕的狀態(tài)下，把其加入預(yù)冷好的研缽中研磨，考慮到不徹底的研磨會(huì)影響RNA的質(zhì)量和收率，應(yīng)該把組織樣品研磨至無明顯可見顆粒的粉末狀(期間應(yīng)持續(xù)加入液氮)。取出1.5mL的滅菌小管子，加入450μL的Buffer PE，再往其中加入20～50mg研磨后的粉末狀樣品。為更好地裂解液中無明顯沉淀，可使用移液器反復(fù)吹打。

將上述裂解液置入離心機(jī)，12000rpm，4℃離心8min。

新取1個(gè)1.5mL滅菌小管子，用移液槍提取350μL上清液，小心加入其中。加入體積為上清液1/10(35μL)的Buffer NB，Vortex震蕩搖勻。

將所得液體置入離心機(jī)，低溫離心，12000rpm，4℃離心5min，以下離心機(jī)均設(shè)為4℃。

將上清液吸取至新的1.5mL滅菌小管子中，此時(shí)槍量程為300μL。加入450μL的Buffer RL(使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入50倍DTT Solution)，使用移液槍將溶液吹打混勻。

按照“Total RNA的提取”流程進(jìn)行以下步驟。

加入375μL C2H5OH，得到1125μL混合液。出現(xiàn)沉淀時(shí)使用移液槍將溶液吹打混勻。

第1次用移液槍吸600μL轉(zhuǎn)入柱子，離心1min，12000rpm。棄濾液。第2次將剩余525μL混合液轉(zhuǎn)入柱子中，離心1min，12000rpm。棄濾液。

在柱子中加入500μL 的Buffer RWA，12000rpm，離心1min，棄濾液。

在柱子中加入600μL的Buffer RWB，12000rpm，離心1min，棄濾液。(確認(rèn)Buffer RWB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇)沿柱子管壁四周加入Buffer RWB，有助于沖洗粘附在壁管上的鹽分。

(1)管，將配制好的酶液加入50μL至柱子中，此時(shí)槍頭一定要伸到柱子中間，放置15min。(2)管，向柱子中央加入500μL的Buffer RWB，盡量在邊上繞一圈，離心1min，12000rpm，棄濾液。

在柱子中加入600μL的Buffer RWB，12000 rpm，離心1min，棄濾液。(確認(rèn)Buffer RWB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇)沿柱子管壁四周加入Buffer RWB，有助于沖洗粘附在壁管上的鹽分。

將濾液倒掉，再將管子空轉(zhuǎn)1min。換管子，留中柱。將RNase Free dH2O放在金屬浴上設(shè)置60℃，預(yù)熱5min。此時(shí)將蓋子打開揮發(fā)酒精。每個(gè)中央加入50μL的RNase FreedH2O。加入后放置1～2min，離心2min，12000rpm，此時(shí)有2個(gè)蓋子，扔掉中柱，保留小管子。

配膠：往錐形瓶倒入40mL 1倍的TAE，稱取0.40g瓊脂，將二者混合均勻。用微波爐加熱1～2min，直至藥品呈透明狀。向錐形瓶中加入1滴Eb，混合均勻。準(zhǔn)備做1塊中等大小的膠。使用中梳，將小管子里的RNA用loading Buffer標(biāo)記，依次注入膠孔以及5μL的marker。跑膠時(shí)間大致為30min。

1.2.3 灰霉菌處理對(duì)草莓果實(shí)中轉(zhuǎn)錄因子的影響

表1 灰霉病處理草莓果實(shí)后相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析

2017年4月24日在凝膠成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，(1)管8μL打到每個(gè)小管子里，放小離心機(jī)上離心。每個(gè)吸取2μL上次試驗(yàn)的RNA打到管底。將每個(gè)小管子置于金屬浴顯示65℃，預(yù)熱5min。小管子插到制冰機(jī)上，4～5min直至冷卻。將(2)管加入至小管子，每個(gè)為10μL(移液速度要快，加在管壁上)，放在小離心機(jī)上離心。如果放置時(shí)間長，應(yīng)儲(chǔ)存在冰上。第2天，用移液槍加23μL PCR mix進(jìn)入每個(gè)小管子，將每個(gè)草莓的cDNA吸2μL分別加入小管子。放置在小離心機(jī)上離心。放置在PCR儀上進(jìn)行PCR檢測(cè)。此時(shí)做膠，用大梳(孔數(shù)要夠)將每個(gè)小管子的25μL溶液全部點(diǎn)進(jìn)去，此時(shí)不需用loading Buffer標(biāo)記。點(diǎn)入marker 5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰霉菌處理對(duì)不同發(fā)育時(shí)期草莓果實(shí)的影響

2016年12月26日將草莓刺傷并接種灰霉菌，同年12月31日肉眼觀察部分草莓病變。從試驗(yàn)結(jié)果分析，不同發(fā)育階段的草莓果實(shí)對(duì)灰霉病表現(xiàn)出不同程度的病變，5d時(shí)間中未用病菌處理的草莓對(duì)照組肉眼觀察暫未發(fā)病，見圖1。本試驗(yàn)過程中即將成熟的草莓果實(shí)最先病變，表明灰霉病主要危害果實(shí)，在即將成熟的果實(shí)上最易發(fā)病[1]。

圖1 草莓果實(shí)經(jīng)過5d灰霉菌液處理

2.2 草莓果實(shí)RNA的提取

利用Protocl-I流程從100mg的草莓果實(shí)中提取RNA，從圖2可知，得到了濃度高低將近相同的RNA。

泳道1：綠果；泳道2：綠果對(duì)照；泳道3：白果；泳道4：白果對(duì)照；泳道5：紅果；泳道6：紅果對(duì)照；泳道7：marker

2.3 灰霉菌處理對(duì)草莓果實(shí)中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的影響

從圖3可知，圖片亮度大致相同，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的內(nèi)參基因，此為得到的RNA濃度基本相同，可以進(jìn)行以下試驗(yàn)，見圖4。

泳道1：綠果；泳道2：綠果對(duì)照；泳道3：白果；泳道4：白果對(duì)照；泳道5：紅果；泳道6：紅果對(duì)照；泳道7：marker

圖4 抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

栽培作物的過程中，會(huì)有多種多樣的病菌微生物侵害植物，本試驗(yàn)主要分析灰霉病處理草莓果實(shí)后相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量。試驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的草莓果實(shí)灰霉病發(fā)病時(shí)間和發(fā)病狀態(tài)不同。4個(gè)抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY70、ERF3以及NAC1在受到灰霉病侵染后，基因表達(dá)量均有不同程度上調(diào)。本試驗(yàn)過程中，PCR擴(kuò)增得到的RNA量大致相等，試驗(yàn)較為順利?，F(xiàn)今已有大量關(guān)于草莓灰霉病的分子實(shí)驗(yàn)，Rigotti等[9]對(duì)灰霉病菌處理過的草莓進(jìn)行了分子實(shí)驗(yàn)[10]。本試驗(yàn)材料為八倍體“紅顏”品種，查閱草莓灰霉病相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子文獻(xiàn)，了解到這方面的研究相對(duì)二倍體草莓較少，因此將繼續(xù)在分析基因表達(dá)的研究上，對(duì)草莓灰霉病的相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行更深層次的試驗(yàn)分析。