結(jié)合光學(xué)掩模調(diào)制的鼠眼像差精確測量

王 亮，孔 文，何 益*，黃江杰，史國華

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 安徽 合肥 230026；2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所, 江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

眼睛是唯一一個可以通過光學(xué)方法非侵入觀察血管的器官，眼底成像一直是研究中央神經(jīng)系統(tǒng)和血管相關(guān)疾病的熱點(diǎn)[1-4]。此外，眼底成像對于篩選、觀察視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展或監(jiān)測治療效果也具有重要意義。近年來，通過在眼底成像中引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)[5-7]，實(shí)時測量眼睛光學(xué)系統(tǒng)像差并通過閉環(huán)校正，可以實(shí)現(xiàn)視細(xì)胞級的高分辨率成像[8-11]，從而將臨床上病理研究從組織尺度提升到了細(xì)胞尺度，可以使視網(wǎng)膜疾病與其他相關(guān)病理改變的研究周期顯著提前，有望實(shí)現(xiàn)疾病的早期診療。

在病理研究中，開展動物試驗(yàn)是必須的[12-15]。作為一種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物，小鼠是研究人類眼科疾病使用最廣泛的哺乳動物模型[16-19]，其具有與人眼相似的眼底結(jié)構(gòu)[20]，其更大的數(shù)值孔徑具有更高的成像分辨率[21]，并且容易獲得、生長迅速、培育簡單，是開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的理想實(shí)驗(yàn)樣本。

自適應(yīng)光學(xué)成像借助波前探測和補(bǔ)償方法，實(shí)現(xiàn)衍射極限成像。自適應(yīng)光學(xué)成像的基礎(chǔ)是精確的波前探測。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠視網(wǎng)膜有多層反射光，若多層反射光同時進(jìn)入像差探測器，則無法進(jìn)行區(qū)分，極易導(dǎo)致波前探測失敗。為了解決鼠眼波前探測失效的問題，羅切斯特大學(xué)的Geng Y 等人設(shè)計了一種偏向特定視網(wǎng)膜層光線的夏克—哈特曼波前傳感器(SHWS)[22]，可以抑制視網(wǎng)膜其他層反射的光線，從而獲取目標(biāo)層的波前像差信息。斯坦福大學(xué)的AKONDI V 等人則通過完善SHWS 質(zhì)心算法，在波前計算中設(shè)定光強(qiáng)閾值，當(dāng)非目標(biāo)層光線的光強(qiáng)值低于閾值時，可以將其剔除，只保留目標(biāo)層反射光斑，從而可以減少因多層的反射引入的偽像差，提高波前測量精度。

現(xiàn)有技術(shù)條件下，特定哈特曼傳感器的研制復(fù)雜，需要與眼睛光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)配合，通用性較差。利用算法去除非目標(biāo)層偽像差的方法，也會使目標(biāo)層光線強(qiáng)度降低，導(dǎo)致部分像差測量效果欠佳?？紤]到小鼠等哺乳類動物視網(wǎng)膜可以認(rèn)為是兩層反射面[23-27]，兩層反射光束的強(qiáng)度差異并不明顯，但是在光束傳播過程中，存在兩層反射光束出現(xiàn)分離的位置。因此，本文提出在鼠眼波前像差探測系統(tǒng)中，合理設(shè)置一種光學(xué)掩模結(jié)構(gòu)，直接遮攔視網(wǎng)膜非目標(biāo)層的反射光線，只允許目標(biāo)層的反射光線進(jìn)入波前測量，以提升鼠眼波前像差的測量精度。結(jié)合仿真分析結(jié)果可以得到針對小鼠視網(wǎng)膜的光學(xué)掩?？讖匠叽鐓?shù)。對在體小鼠視網(wǎng)膜像差的測量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法可以實(shí)現(xiàn)波前像差測量誤差的均方根（RMS）值下降74.9%，與理論仿真結(jié)果相近，說明本文所提方法有效提升了鼠眼波前像差的測量精度。

2 原理與方法

2.1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與掩模遮攔方案

本實(shí)驗(yàn)采用透射式光學(xué)元件的掃描型波前探測系統(tǒng)，采用SHWS 完成波前像差測量。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1 所示，中心波長為830 nm 的單模光纖耦合激光器LD（SFOLT, FC-830-030-SM, 光譜線寬FWHM<2 nm）發(fā)出的光束經(jīng)準(zhǔn)直后由光闌(diaphragm)調(diào)制為7 mm 孔徑光束，經(jīng)分光鏡BS1（透反比50∶50）反射至平面反射鏡(reflector)。雙膠合消色差透鏡AL1 和AL2 起到調(diào)制光束直徑的作用，并且能夠最大限度地校正系統(tǒng)球差。高速掃描振鏡G1（CTI, CRS）用以完成水平方向的光點(diǎn)掃描，其掃描頻率為8 kHz。非球面透鏡L1 和L2 的直徑相匹配，可以維持良好的系統(tǒng)像差修正效果。掃描振鏡G2（Sunny, S-8107）用以完成豎直方向的光點(diǎn)掃描，其掃描頻率為50 Hz。光線經(jīng)過G2 后依次經(jīng)過非球面透鏡L3 和非球面透鏡L4，最終進(jìn)入待測鼠眼瞳孔，經(jīng)眼底視網(wǎng)膜散射后，信標(biāo)光沿光軸原路返回，經(jīng)分光鏡BS1 透射，進(jìn)入BS2（透反比為50∶50），再經(jīng)BS2 反射后進(jìn)入波前傳感器SHWS，完成鼠眼的波前像差測量。

圖1 鼠眼波前像差探測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of mouse eye wavefront detection system

圖1 中，SHWS 的微透鏡陣列焦距為5.6 mm，微透鏡間距為150 μm，厚度為1.2 mm，尺寸為10 mm×10 mm。通過CMOS 面陣相機(jī)（BASLER acA1300-60gm）記錄光斑。對于2 mm 直徑的小鼠瞳孔，波前傳感器可獲取18×18 的波前光斑圖像，利用傳統(tǒng)的質(zhì)心算法最終復(fù)原得到小鼠的波前像差，以標(biāo)準(zhǔn)35 階Zernike 多項(xiàng)式進(jìn)行描述。

具體地，如圖2（彩圖見期刊電子版）所示，在體鼠眼波前像差測量時，視網(wǎng)膜雙反射層結(jié)構(gòu)會同時反射回兩束信標(biāo)光，SHWS 的相機(jī)靶面同時接收到這兩束信標(biāo)光，導(dǎo)致每個子孔徑內(nèi)的光斑點(diǎn)陣互有重疊，無法完成波前測量。通過仿真分析發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜雙層反射回來的信標(biāo)光束，在光路中間存在分離現(xiàn)象，其中，在L1 和L2 之間的焦面附近，兩束信標(biāo)光的分離距離最大。因此，本文提出在該位置設(shè)置光學(xué)掩模，以對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束進(jìn)行遮擋，如圖1 所示。該光學(xué)掩模為中心透光小孔，其通過透明玻璃基底上鍍制黑色遮光材料制成。掩模的遮光區(qū)域是沿光軸孔徑以外的所有區(qū)域，確保進(jìn)入SHWS 的光線為沿光軸傳輸攜帶視網(wǎng)膜目標(biāo)層信息的信標(biāo)光，從而提高波前測量精度。

圖2 鼠眼視網(wǎng)膜雙層反射原理示意圖Fig.2 The principle diagram of retinal double layer reflection in mouse eye

2.2 系統(tǒng)仿真分析

通過光學(xué)設(shè)計軟件Zemax OpticStudio 進(jìn)行系統(tǒng)仿真，首先，根據(jù)各項(xiàng)參數(shù)[28-29]在序列模式下建立鼠眼光學(xué)模型，包括鼠眼角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜的厚度、折射率及前后曲率等參數(shù)，如表1 所示。其中關(guān)鍵參數(shù)包括：視網(wǎng)膜厚度t= 0.22 mm，視網(wǎng)膜焦距f1= 46.54 mm 以及鼠眼焦距f2=1.96 mm。

表1 Zemax 鼠眼模型參數(shù)Tab.1 Zemax parameters of the mouse eye model

由于對于鼠眼視網(wǎng)膜光束的散射特性尚無具體模型，本研究考慮以鼠眼視網(wǎng)膜的雙層反射為標(biāo)準(zhǔn)，在非序列模式下，建立起視網(wǎng)膜—波前傳感器的雙光源逆向光學(xué)模型。首先設(shè)置相距0.22 mm的2 個圓形標(biāo)準(zhǔn)面光源以模擬視網(wǎng)膜雙層反射光（層2 在前，層1 在后），并在層2 后放置焦距為46.54 mm 的近軸透鏡以模擬視網(wǎng)膜焦距（圖2 中未示出）、層1 后放置焦距為1.97 mm 的近軸透鏡以模擬眼球，然后根據(jù)探測系統(tǒng)的光學(xué)元件依次完成建模，由波前傳感器SHWS 采集模擬鼠眼波前像差。

仿真中，未使用光學(xué)掩模時，SHWS 采集到的光斑點(diǎn)陣同時含有雙層反射信標(biāo)光，每個子孔徑內(nèi)的光斑點(diǎn)陣重疊嚴(yán)重，如圖3(a)所示。光斑點(diǎn)陣的列截面輻照度分布如圖3(b)所示，縱坐標(biāo)數(shù)值經(jīng)歸一化處理，橫坐標(biāo)代表光斑在相機(jī)感光芯片上的位置，單位為毫米?？梢园l(fā)現(xiàn)，由于視網(wǎng)膜的雙層反射作用，光軸附近的輻照度顯著增加，峰值輻照度約為邊緣處峰值的1.5 倍，且邊緣孔徑處會出現(xiàn)兩個輻照度峰值，在相機(jī)靶面上表現(xiàn)為點(diǎn)陣混疊，這會直接影響波前測量的精確度，導(dǎo)致波前測量失效。

圖3 無掩模時的波前點(diǎn)陣采集圖Fig.3 Wavefront spot array diagram without mask

如圖1 所示，在非球面透鏡L1 與L2 之間的焦面位置處設(shè)置光學(xué)掩模，掩模的預(yù)設(shè)通光孔徑分別為0.2 mm、0.5 mm 和0.8 mm，放入不同孔徑掩模后，SHWS 采集到的波前點(diǎn)陣圖及其列截面圖，分別如圖4(a)～4(f)所示，其中列截面圖均已做歸一化處理。

圖4 不同孔徑掩模的波前點(diǎn)陣圖及歸一化的列截面圖。(a)、(b) 0.2 mm 孔徑掩模；(c)、(d) 0.5 mm 孔徑掩模；(e)、(f) 0.8 mm孔徑掩模Fig.4 Wavefront spot array with different aperture masks and normalized column cross sections.(a), (b) Mask with 0.2 mm aperture; (c), (d) mask with 0.5 mm aperture; (e), (f) mask with 0.8 mm aperture

可以明顯地看出，使用光學(xué)掩模進(jìn)行遮攔后，鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束被有效阻攔，不會進(jìn)入波前探測器，波前光斑點(diǎn)陣圖的子孔徑內(nèi)光斑銳利，并且?guī)缀鯖]有重疊。結(jié)合波前點(diǎn)陣圖的列截面輻照度分布進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論：3 種不同孔徑大小的光學(xué)掩模對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光均具有遮攔效果，且隨著孔徑的增加，非目標(biāo)層反射光的遮擋有效區(qū)域有所下降，0.2 mm 孔徑掩?？梢詫?shí)現(xiàn)對93.75%非目標(biāo)層反射光的有效遮攔，另外兩種孔徑分別可以實(shí)現(xiàn)81.94%和66.36%的有效遮攔。因此，由仿真分析結(jié)果可知，0.2 mm孔徑的光學(xué)掩模的遮攔效果最佳，但是，考慮到安裝精度及容錯率等因素，本文采用0.5 mm 孔徑的光學(xué)掩模開展實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)與分析

3.1 系統(tǒng)標(biāo)定與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

采用如圖1 所示的波前探測系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)開始前，使用模擬鼠眼完成系統(tǒng)標(biāo)定，模擬鼠眼的波前探測結(jié)果，如圖5（彩圖見期刊電子版）所示，其中，圖5(c)中縱軸代表光斑歸一化灰度值（光斑沿(a)中虛線位置采集），橫軸代表光斑位置。由于模擬鼠眼的眼底為單層反射結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)采集的波前光斑銳利、均勻、無重疊，系統(tǒng)的波前像差RMS 值為0.017λ，表明系統(tǒng)本身像差極小，可以忽略，不會對實(shí)際鼠眼像差測量結(jié)果引入系統(tǒng)誤差。

圖5 模擬鼠眼波前采集圖Fig.5 Simulated mouse eye wavefront acquisition diagrams

隨后，準(zhǔn)備4 只12 周的C57BL/6J 黑色小鼠組成實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行波前像差測量實(shí)驗(yàn)。備有保溫墊或加熱墊，防止實(shí)驗(yàn)過程中小鼠因失溫而造成的生理功能下降；同時備以生理鹽水滴管，維持角膜水合防止晶狀體混濁。根據(jù)1 ml/100 g 的劑量對實(shí)驗(yàn)小鼠依次注射濃度為4%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，時間為5 min，麻醉后左右眼各使用一滴濃度為0.5%的托吡卡胺和鹽酸去氧腎上腺素溶液將其瞳孔散開至2 mm，然后放置在XYZ三軸位移臺上開展波前像差探測實(shí)驗(yàn)。

3.2 在體鼠眼波前測量

利用圖1 所示的波前像差探測系統(tǒng)，對4 只小鼠共8 只眼睛開展波前像差測量實(shí)驗(yàn)。其中，1 只小鼠的左眼存在白內(nèi)障，1 只小鼠的右眼視力嚴(yán)重缺陷，波前像差數(shù)據(jù)偏差巨大，最終將4 只小鼠共6 只眼的波前像差測量數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計分析。

如上所述，來自鼠眼視網(wǎng)膜的非目標(biāo)層反射光與目標(biāo)層信標(biāo)光同時進(jìn)入SHWS，導(dǎo)致鼠眼波前像差采集時每個子孔徑內(nèi)的光斑發(fā)生重疊，具體表現(xiàn)為采集到的Zernike 像差多項(xiàng)式系數(shù)中低階成分居多且數(shù)值較大，即像差測量誤差較大、波前測量結(jié)果失準(zhǔn)。此外，由于系統(tǒng)是掃描型系統(tǒng)，波前探測器的相機(jī)接收到的信息為多個子光斑混合在一起的總光斑信息，雙層反射光斑的疊加表現(xiàn)為波前像差峰谷（P-V）值的增加及波前像差均方根（RMS）值的增加。當(dāng)波前探測器只接收到目標(biāo)層視網(wǎng)膜的反射信標(biāo)光時，不受雙層反射

統(tǒng)計采集到的鼠眼波前像差數(shù)據(jù)后，比較分析得出：不使用光學(xué)掩模時，納入統(tǒng)計的鼠眼波前像 差 平 均P-V 值 約 為2.933 μm（3.53λ），平 均RMS 值約為0.639 μm（0.77λ）；而使用掩模后的鼠眼波前像差平均P-V 值約為0.709 μm（0.85λ），平均RMS 值約為0.160 μm（0.19λ）。6 只鼠眼的光斑疊加的影響，波前像差的P-V 值、RMS 值均會下降，像差測量精度得到提升。

為了直觀顯示波前測量效果，隨機(jī)選取有效數(shù)據(jù)中的一只鼠眼波前測量結(jié)果為例進(jìn)行分析，其添加光學(xué)掩模前后的波前點(diǎn)陣圖及中心光斑歸一化灰度圖如圖6（彩圖見期刊電子版）所示。其中，圖6(b)、6(e)中縱軸代表光斑歸一化灰度值（光斑沿6(a)、6(d)中虛線位置采集），橫軸代表光斑位置。結(jié)果顯示，未使用掩模調(diào)制時，圖6(b)中各子孔徑光斑峰值差異較大，中心峰值約為兩側(cè)峰值的1.3～2 倍，與仿真模擬的1.5 倍峰值差異近似。此外，由部分峰值曲線可以得知光斑重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，表現(xiàn)為更高的P-V 值和RMS 值，導(dǎo)致波前像差測量失效。使用0.5 mm 孔徑掩模調(diào)制后，圖6(e)中，除中心區(qū)域外，兩側(cè)區(qū)域峰值差異明顯降低，(d)中各個子孔徑內(nèi)亮度較為均勻，即除去了視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響，更小的P-V 值和RMS 值也驗(yàn)證了掩模調(diào)制方案的有效性。35 階Zernike 波前像差各項(xiàng)系數(shù)如圖7、圖8（彩圖見期刊電子版）所示，其中顏色代表Zernike 像差的階次，其中一階像差和二階像差（前五項(xiàng)）統(tǒng)稱為低階像差，其余項(xiàng)則為高階像差。需要注意的是，低階像差和高階像差使用不同的刻度值，圖中誤差棒代表±2 倍的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。

圖7 無掩模時，6 只鼠眼的Zernike 多項(xiàng)式系數(shù)均值分布圖，誤差棒為±2 SEFig.7 Mean distribution of Zernike polynomial coefficients in 6 mouse eyes without mask, error bar:±2 SE

圖8 有掩模時，6 只鼠眼的Zernike 多項(xiàng)式系數(shù)均值分布圖，誤差棒為±2 SEFig.8 Mean distribution of Zernike polynomial coefficients in 6 mouse eyes with mask, error bar: ±2 SE

分析數(shù)據(jù)可得，使用掩模后測得的鼠眼波前像差Zernike 多項(xiàng)式系數(shù)的RMS 值從0.639 μm（0.77λ）下降至0.160 μm（0.19λ），下降74.93%，接近仿真分析有效遮攔的80%。其中，有效遮攔區(qū)域可以用于定量描述鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束的遮攔效果，有效遮攔區(qū)域越高意味著鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響越小，波前像差測量越準(zhǔn)確，例如實(shí)現(xiàn)100%有效遮攔時，可被視為對鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的遮攔效果最理想。而存在的部分遮攔失效，主要源于視網(wǎng)膜實(shí)際的散射光束效應(yīng)，散射光束與仿真分析采用的反射光束本身存在一定的誤差，經(jīng)過實(shí)際測量統(tǒng)計，該誤差值較小，表明采用光學(xué)掩模調(diào)制后，在體鼠眼的波前測量精度得到有效提升。

4 結(jié) 論

針對鼠眼視網(wǎng)膜雙層反射光重疊導(dǎo)致的波前像差探測失效問題，本文經(jīng)過仿真分析發(fā)現(xiàn)雙層反射光束在探測系統(tǒng)光路中存在位置分離?；诖?，本文提出一種結(jié)合光學(xué)掩模調(diào)制的鼠眼像差測量方法，可以直接遮攔視網(wǎng)膜非目標(biāo)層的反射光束，允許鼠眼視網(wǎng)膜目標(biāo)層的反射光完成波前測量。結(jié)合仿真分析結(jié)果，不同孔徑尺寸的掩模對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的遮攔效果不同，隨著孔徑尺寸的增加，遮攔效果逐漸下降?？紤]到實(shí)驗(yàn)安裝精度的限制，選擇通光孔徑為0.5 mm 的掩模，可以實(shí)現(xiàn)SHWS 探測器接收面上80%左右的區(qū)域不受視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響。小鼠的在體波前像差測量數(shù)據(jù)表明，通光孔徑為0.5 mm 的掩模可以使波前測量時各項(xiàng)像差系數(shù)的RMS 值降低約74.9%，與仿真結(jié)果相近。本文所提方法有效提升了鼠眼波前像差測量精度，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)鼠眼高分辨率成像奠定了基礎(chǔ)。