基于銅死亡相關(guān)基因構(gòu)建肺腺癌預(yù)后模型和藥物敏感性分析

孫繼宏 張瀚文 劉浩然 董雨晴 王萍玉

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的主要原因，近十幾年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率與死亡率逐年攀升[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的重要病理類(lèi)型，占所有肺癌病例的80%以上[2]，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是NSCLC的主要組織學(xué)亞型，約占所有肺癌病例的50%，并且其發(fā)病率正在逐年增加[3]。盡管目前LUAD的診斷技術(shù)和治療手段已獲得了很大的進(jìn)步，但因?yàn)樵缙诎l(fā)現(xiàn)難、轉(zhuǎn)移率高及長(zhǎng)期缺乏系統(tǒng)診斷治療等因素[4]，LUAD患者的預(yù)后仍然很差，5年生存率僅為10%- 20%[5]。所以，為L(zhǎng)UAD患者識(shí)別可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

銅是人體必需的微量元素，也是各種酶促反應(yīng)的必要輔助調(diào)節(jié)劑[6]。2022年，Tsvetkov等[7]提出了銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，稱(chēng)為銅死亡。有研究[8]發(fā)現(xiàn)銅死亡發(fā)生機(jī)制主要受到線(xiàn)粒體呼吸的影響，是銅直接與三羧酸循環(huán)的脂?；煞窒嗷プ饔?，導(dǎo)致脂?；鞍踪|(zhì)異常聚集和鐵硫簇蛋白質(zhì)缺失。最近的研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，銅死亡相關(guān)基因（cuproptosis related gene, CRGs）與人類(lèi)癌癥之間存在密切關(guān)系，但是，銅誘導(dǎo)的腫瘤死亡調(diào)控機(jī)制及在LUAD中的作用及臨床意義尚不明確。

因此，本研究通過(guò)整合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因型-組織表達(dá)資料庫(kù)（Genotype-tissue Expression, GTEx）中LUAD轉(zhuǎn)錄組及臨床數(shù)據(jù)，建立基于CRGs的LUAD患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，全面探索CRGs在LUAD中的分子機(jī)制及臨床意義，并通過(guò)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus, GEO）進(jìn)行驗(yàn)證，為L(zhǎng)UAD的預(yù)后和臨床治療提供有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 查閱最新文獻(xiàn)獲得19個(gè)CRGs[12]，分別為SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、FDX1、DLD、DLST、DBT、LIAS、DLAT、GCSH、ATP7A、ATP7B、NFE2L2、NLRP3、LIPT2、MTF1、GLS、CDKN2A。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/repository）獲取LUAD的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息，包括59個(gè)正常和541個(gè)LUAD樣本的數(shù)據(jù)集。為彌補(bǔ)正常樣本不足，從Xena公共數(shù)據(jù)中心（https://xenabrowser.net）GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中下載288個(gè)正常樣本。采用“l(fā)imma”包將GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中FPKM格式的RNA-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM格式，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批量歸一化，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合統(tǒng)一為T(mén)PM格式。通過(guò)“TCGAbiolinks”R包獲取TCGA體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，并下載拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV），繪制CNV景觀[13]。

1.2 CRGs共表達(dá)及差異分析 在R語(yǔ)言中使用“l(fā)imma”提取19個(gè)CRGs的表達(dá)量，再將CRGs與mRNAs進(jìn)行共表達(dá)分析，過(guò)濾條件為|R|＞0.5且P＜0.001，識(shí)別CRGs[14]。之后識(shí)別正常組與LUAD組之間差異表達(dá)的CRGs，以|logFC|＞2且FDR＜0.05為過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，并以火山圖進(jìn)行可視化[15]。

1.3 LUAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建和評(píng)估 單因素Cox回歸分析篩選LUAD預(yù)后相關(guān)性CRGs，Lasso-Cox回歸篩選獨(dú)立預(yù)后的CRGs并構(gòu)建預(yù)后模型，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程：Riskscore=（回歸系數(shù)*mRNA1EXP）+（回歸系數(shù)*mRNA2EXP）+......+（回歸系數(shù)*mRNAnEXP）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)劃分高、低風(fēng)險(xiǎn)組，通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)模型熱圖和Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)評(píng)估高低風(fēng)險(xiǎn)組總生存期（overall survival, OS）、無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS），繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線(xiàn)以評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效能。

1.4 列線(xiàn)圖的構(gòu)建與評(píng)估 利用“rms”包將預(yù)后相關(guān)的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，確定獨(dú)立預(yù)后因素納入列線(xiàn)圖預(yù)測(cè)模型，并且利用校準(zhǔn)曲線(xiàn)和決策分析（decision curve analysis, DCA）評(píng)估預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

1.5 免疫相關(guān)分析 查閱文獻(xiàn)收集到49個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因（immune checkpoint genes, ICGs）[16]，繪制箱式圖評(píng)估LUAD高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間的ICGs的差異。通過(guò)TIMER、CIBERSORT、CIBERSORTABS等7種計(jì)算方法分析免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的浸潤(rùn)情況，以熱圖的形式進(jìn)行展示[17]。評(píng)估兩組免疫功能、免疫檢查點(diǎn)的差異，繪制箱線(xiàn)圖展示。通過(guò)TIDE網(wǎng)站（http://tide.dfci.harvard.edu/）計(jì)算每例LUAD患者TIDE分?jǐn)?shù)，比較兩組差異。使用R軟件的“ggpubr”包評(píng)估LUAD患者高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間TIDE打分，以小提琴圖進(jìn)行可視化[18]。

1.6 免疫治療潛在藥物的篩選 使用“oncoPredict”包繪制箱線(xiàn)圖，預(yù)測(cè)高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)常見(jiàn)抗癌藥物的治療反應(yīng)，根據(jù)半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）進(jìn)行藥物敏感性預(yù)測(cè)，評(píng)估LUAD高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)臨床上經(jīng)常使用癌癥治療藥物敏感性的差異[19]。

1.7 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取表達(dá)數(shù)據(jù) 在PubMed主頁(yè)面搜索欄中找到GEO datasets選項(xiàng)，進(jìn)入GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，在搜索框中輸入檢索關(guān)鍵詞“l(fā)ung cancer”，篩選條件設(shè)置為“Homo sapiens"，下載芯片中矩陣及平臺(tái)文件。采用R語(yǔ)言軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和矯正。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Perl 5.30.0版和R4.2.3版及相關(guān)的R程序包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LUAD中19個(gè)CRGs的景觀 19個(gè)CRGs在LUAD中的突變頻率相對(duì)較低，其中NLRP3突變頻率最高（12%），其次是CDKN2A和ATP7A（5%），F(xiàn)DX1、LIAS、LIPT1、SLC31A1、LIPT2、PDHB和GCSH在LUAD腫瘤組織中未顯示突變（圖1A）。圖1B展示了CNV改變?cè)谌旧w上的詳細(xì)位置。CNV分析顯示，CDKN2A、DBT、FDX1、DLAT、DLST、GCSH、PDHA1和PDHB的CNV丟失頻率較高，而其他基因的CNV增益頻率較高（圖1C）。19個(gè)CRGs在LUAD患者中的異質(zhì)性表達(dá)模型表明，它們可能在疾病的發(fā)展和進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。

2.2 LUAD中CRGs篩選結(jié)果 通過(guò)共表達(dá)分析共得到1656個(gè)CRGs，使用?；鶊D展示19個(gè)CRGs與1656個(gè)CRGs之間的共表達(dá)關(guān)系（圖2A）。將GTEx資料庫(kù)中288個(gè)正常肺組織的mRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)與1656個(gè)CRGs取交集并進(jìn)行差異分析，得到1356個(gè)差異表達(dá)的CRGs，結(jié)果以火山圖的形式展示（圖2B）。

2.3 基于mRNA的LUAD預(yù)后模型的構(gòu)建 剔除生存時(shí)間＜30 d和臨床數(shù)據(jù)缺失的樣本，剩余472例患者納入分析，使用單因素Cox回歸分析篩選出284個(gè)具有預(yù)后作用的mRNA，再將上述mRNA進(jìn)行Lasso-Cox回歸分析，最終確定13個(gè)獨(dú)立預(yù)后mRNA構(gòu)建模型（圖3A、圖3B）。其中，MTMR12、TP63、CRYBG3、PDIK1L和UBR2為L(zhǎng)UAD患者預(yù)后保護(hù)因素，CAMSAP2、ARL17A、MAML2、C5orf24、SLK、HNRNPR、NUP50和STX17為危險(xiǎn)因素（表1），基于這13個(gè)mRNAs建立的LUAD患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程為：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（1.207*ExpCAMSAP2）-（0.803*ExpMTMR12）-（0.574*ExpTP63）+（1.038*ExpARL17A）+（1.019*ExpMAML2）-（1.054*ExpCRYBG3）+（1.301*ExpC5orf24）+（0.855*ExpSLK）-（2.524*ExpPDIK1L）+（3.112*ExpHNRNPR）-（2.106*ExpUBR2）+（1.456*ExpNUP50）+（1.222*ExpSTX17）。繪制相關(guān)性熱圖將13個(gè)CRGs和查閱文獻(xiàn)獲得的19個(gè)CRGs之間的相關(guān)性進(jìn)行可視化（圖3C）。

圖3 基于13個(gè)CRGs的LUAD患者構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。A：LASSO回歸分析；B：λ選擇圖；C：13個(gè)CRGs和19個(gè)CRGs的相關(guān)性熱圖。Fig 3 Risk model constructed for LUAD patients based on 13 CRGs.A: LASSO regression analysis; B: λ selection plot; C: Correlation heatmap of 13 CRGs and 19 CRGs.

表1 本研究通過(guò)數(shù)據(jù)分析鑒定的13種CRGs的多因素Cox回歸分析Tab 1 Multivariate Cox regression analysis of 13 CRGs identified through data analysis in this study

2.4 評(píng)估模型的預(yù)測(cè)價(jià)值 通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算LUAD患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)其中位數(shù)將所有LUAD患者劃分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析結(jié)果表明，低風(fēng)險(xiǎn)組的OS和PFS更長(zhǎng)（均P＜0.001，圖4A、圖4B）。C-index曲線(xiàn)結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的C-index從高到低依次為年齡、性別、種族、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis, TNM）分期、吸煙史、原發(fā)腫瘤位置、放療史（圖4C）。應(yīng)用預(yù)后模型預(yù)測(cè)LUAD患者1、3、5年生存率的曲線(xiàn)下面積（area under the curve, AUC）分別為0.749（95%CI: 0.656-0.826）、0.740（95%CI: 0.681-0.806）和 0.689（95%CI: 0.613-0.776）。繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床特征的ROC曲線(xiàn)顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)于預(yù)測(cè)LUAD患者生存率的準(zhǔn)確性高于其他臨床特征，說(shuō)明我們構(gòu)建的模型優(yōu)于以上臨床參數(shù)對(duì)LUAD患者的生存預(yù)測(cè)（圖4D-圖4F）。

圖4 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后價(jià)值。A：高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者OS的生存曲線(xiàn)；B：高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者PFS的生存曲線(xiàn)；C：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征的C-index曲線(xiàn)；D-F：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與其他臨床特征的1、3、5年ROC曲線(xiàn)。Fig 4 The prognostic value of the risk model was evaluated.A: Survival curves of OS in patients in high and low risk groups; B: Survival curves of PFS in patients with high and low risk groups, C: C-index curves of risk score and clinical features; D-F: 1-, 3- and 5-year ROC curves of risk score and other clinical features.OS: overall survival; PFS: progression-free survival; ROC: receiver operating characteristic; TNM: tumor-node-metastasis.

2.5 GEO數(shù)據(jù)集中CRGs的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證以上CRGs的預(yù)后價(jià)值，通過(guò)外部數(shù)據(jù)集GSE68465其中包括462例肺腺癌樣本，繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后比低風(fēng)險(xiǎn)組差（P＜0.001）。根據(jù)ROC曲線(xiàn)AUC得出，CRGs預(yù)測(cè)患者1、3、5年的生存率AUC分別為0.645、0.639、0.670（圖5）。

圖5 GEO隊(duì)列中LUAD中CRGs的預(yù)后特征。A：GEO隊(duì)列中患者OS的生存曲線(xiàn)；B：GEO隊(duì)列中患者的ROC曲線(xiàn)。Fig 5 Prognostic characteristics of CRGs in LUAD in GEO cohort.A: Survival curve of patient OS in the GEO cohort; B: ROC curves of patient in the GEO cohort.GEO: Gene Expression Omnibus.

2.6 評(píng)估TCGA-LUAD患者的獨(dú)立預(yù)后特征 為了評(píng)估LUAD患者預(yù)后的獨(dú)立因素，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、種族、腫瘤原發(fā)位置、TNM分期、吸煙史和放療史全部納入單因素及多因素Cox回歸分析，將多種臨床特征之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行綜合考慮，結(jié)果顯示TNM分期為II期（HR=2.22,95%CI: 1.53-3.23,P＜0.001）、III期（HR=3.09, 95%CI:2.05-4.64,P＜0.001）、IV期（HR=2.82, 95%CI: 1.54-5.15,P＜0.001）以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為高風(fēng)險(xiǎn)組（HR=2.90, 95%CI:2.08-4.03,P＜0.001）是LUAD患者預(yù)后危險(xiǎn)影響因素（表2）。

表2 LUAD預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis of LUAD prognosis

2.7 構(gòu)建并評(píng)估TCGA-LUAD列線(xiàn)圖預(yù)后模型 將年齡、性別、TNM分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分納入構(gòu)建LUAD患者列線(xiàn)圖模型（圖6A）。列線(xiàn)圖預(yù)測(cè)LUAD患者1、3和5年生存率的AUC分別為0.805、0.803和0.752。與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型相比，列線(xiàn)圖對(duì)LUAD患者生存率的預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確（圖6B）。校準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示列線(xiàn)圖預(yù)測(cè)患者1、3、5年生存率曲線(xiàn)與實(shí)際生存率曲線(xiàn)吻合度較高（圖6C），表明模型準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性強(qiáng)。DCA分析顯示該模型能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)LUAD患者的預(yù)后，可為臨床管理和決策提供參考（圖6D）。

圖6 構(gòu)建及驗(yàn)證LUAD的列線(xiàn)圖預(yù)后模型。A：LUAD患者列線(xiàn)圖模型；B：預(yù)測(cè)LUAD患者的1、3、5年生存率的AUC值；C：列線(xiàn)圖的校準(zhǔn)曲線(xiàn)預(yù)測(cè)LUAD患者的1、3、5年生存率；D：DCA評(píng)估模型的臨床療效。Fig 6 Construction and validation of nomogram prognostic model of LUAD.A: Linegram model of LUAD patients; B: AUC value to predict 1-, 3-, and 5-year survival in LUAD patients; C: The calibration curve of the nomogram predicts the 1-, 3- and 5-year survival rates of LUAD patients; D: Clinical efficacy of DCA evaluation model.DCA: decision curve analysis.

2.8 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫相關(guān)分析 查閱文獻(xiàn)共獲得49個(gè)ICGs（圖7A），差異分析結(jié)果顯示，49個(gè)ICGs中有24個(gè)ICGs在高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者中的表達(dá)量存在差異（P＜0.05），且只有CD276在高風(fēng)險(xiǎn)組中呈高表達(dá)狀態(tài)。表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與ICGs具有較強(qiáng)的相關(guān)性（圖7B）。通過(guò)TIDE網(wǎng)站（http://tide.dfci.harvard.edu/）對(duì)LUAD高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫治療反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的得分高于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（P＜0.001，圖7C），說(shuō)明低風(fēng)險(xiǎn)組患者發(fā)生免疫逃逸的可能性較低，對(duì)免疫治療的效果可能會(huì)更好。采用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL和EPIC等7種方法評(píng)估免疫細(xì)胞相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞在低風(fēng)險(xiǎn)組表達(dá)較高，如記憶B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、記憶靜息CD4+T細(xì)胞等，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖8A），即低風(fēng)險(xiǎn)組患者表現(xiàn)出強(qiáng)免疫狀態(tài)。在免疫功能差異分析的箱線(xiàn)圖中，低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能的得分更高，說(shuō)明低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能更加活躍，例如人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）功能等（P＜0.001，圖8B）。

圖7 高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫微環(huán)境分析。A：49個(gè)免疫相關(guān)基因；B：免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)差異分析；C：高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫逃逸和免疫治療。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。Fig 7 Immune microenvironment analysis of high- and low-risk groups.A: 49 immune-related genes; B: Gene expression difference analysis at immune checkpoints ; C: Immune escape and immunotherapy in patients in high and low risk groups.*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001.

圖8 高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能和免疫細(xì)胞分析。A：高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫細(xì)胞相關(guān)性分析；B：高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能差異分析。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。Fig 8 Immune function and immune cell analysis in high- and low-risk groups.A: Correlation analysis of immune cells in patients with high and low risk; B: Analysis of differences in immune function between high and low risk groups.*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001.

2.9 潛在藥物敏感性分析 使用“oncoPredict”包篩選LUAD患者對(duì)198種抗腫瘤藥物的IC50值。其中橫坐標(biāo)代表LUAD高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者，縱坐標(biāo)代表IC50值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組患者的IC50值較低，說(shuō)明高風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)薩沃替尼、帕博西尼、阿糖胞苷、拉唑帕尼、福替尼、MDM2抑制劑等藥物敏感性更高（P＜0.01，圖9），更有利于接受藥物治療。

圖9 高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間藥物敏感性差異分析。A：薩沃替尼；B：帕博西尼；C：阿糖胞苷；D：拉唑帕尼；E：福替尼；F：MDM2抑制劑。Fig 9 Analysis of drug sensitivity differences between high and low risk groups.A: Savolitinib; B: Palbociclib; C: Cytarabine; D: Talazopanib; E:Foretinib; F: Nutlin-3a(-).IC50: half maximal inhibitory concentration.

3 討論

肺癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，盡管腫瘤篩查和治療手段不斷完善，但由于肺癌的異質(zhì)性和侵襲性，其5年生存率仍然很低，改善患者的不良預(yù)后情況迫在眉睫[20]。銅死亡是最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡類(lèi)型，是由于細(xì)胞內(nèi)過(guò)量銅離子積累引發(fā)的，有研究[21]已經(jīng)確定其與LUAD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本研究通過(guò)整合TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建了一個(gè)由13個(gè)CRGs構(gòu)成的LUAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，其中MTMR12、TP63、CRYBG3、PDIK1L和UBR2為L(zhǎng)UAD患者預(yù)后保護(hù)因素，CAMSAP2、ARL17A、MAML2、C5orf24、SLK、HNRNPR、NUP50和STX17為危險(xiǎn)因素，其中許多基因已經(jīng)被鑒定出來(lái)了。例如，TP63是抑癌基因TP53的家族成員，該基因家族對(duì)細(xì)胞分化和應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要，TP63的多態(tài)性變異與LUAD的增殖與發(fā)生密切相關(guān)。CRYBG3過(guò)量表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞死亡，作用機(jī)制是通過(guò)CRYBG3直接與G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合來(lái)阻斷細(xì)胞分裂，可作為抑制劑抑制體內(nèi)腫瘤發(fā)展。NSCLC的發(fā)展過(guò)程可以通過(guò)敲低circSOD2的表達(dá)，然后上調(diào)CAMSAP2和miR-2355-5p來(lái)逆轉(zhuǎn)。CAMSAP2是miR-2355-5p的靶點(diǎn)，其在NSCLC細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)。MAML2基因異位通過(guò)破壞正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，對(duì)原發(fā)性肺黏液表皮樣癌患者生存率產(chǎn)生顯著影響。在LUAD中HNRNPR的蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常組織，晚期患者HNRNPR表達(dá)顯著升高，提示HNRNPR可能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[22-26]。總之，這些基因在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，進(jìn)一步研究可能會(huì)為L(zhǎng)UAD患者提供新的治療策略。

先前研究[27]構(gòu)建的基于6個(gè)CRGs的LUAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型中患者1、3、5年生存率的AUC分別為0.639、0.605、0.576，而本研究中應(yīng)用生存分析、ROC、校準(zhǔn)曲線(xiàn)評(píng)估了模型的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS和PFS高于高風(fēng)險(xiǎn)組患者且預(yù)測(cè)LUAD患者1、3和5年生存率的AUC分別為0.749、0.740和0.689。因此與以往LUAD中發(fā)表的CRGs風(fēng)險(xiǎn)模型相比，本研究構(gòu)建的模型更加精確可靠，對(duì)LUAD患者預(yù)后預(yù)測(cè)效果更好。

免疫功能與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中起著不可或缺的作用[28]。免疫功能分析顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組患者更多地參與漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、人類(lèi)白細(xì)胞抗原、II型干擾素反應(yīng)等免疫功能。我們采用七種方法評(píng)估免疫細(xì)胞相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)記憶B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、記憶靜息CD4+T細(xì)胞等免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在低風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)。ICGs差異分析顯示，只有CD276在高風(fēng)險(xiǎn)組中呈高表達(dá)狀態(tài)。CD276在惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移免疫逃逸密切相關(guān)，由于CD276在多種腫瘤中的表達(dá)水平升高，有研究[29]使用CD276作為腫瘤基因治療和單克隆抗體治療的靶標(biāo)。高風(fēng)險(xiǎn)組患者的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）免疫浸潤(rùn)水平較低，兩組免疫功能存在差異。說(shuō)明銅死亡與腫瘤免疫相互影響，高風(fēng)險(xiǎn)組中免疫功能可能受到抑制。

本研究繼續(xù)探索了不同風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)免疫治療的反應(yīng)，其藥物敏感性在兩個(gè)組別中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且高風(fēng)險(xiǎn)組患者更加敏感。有研究[30]表明薩沃替尼是一種選擇性間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition, MET）抑制劑，可應(yīng)用于多種惡性腫瘤。本研究中高風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)以上藥物的IC50值較低，更適合以上藥物治療，可為臨床治療中的藥物選擇提供了理論支持。

本研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了LUAD中CRGs的預(yù)后模型，并驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和應(yīng)用價(jià)值，該模型能更好地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。但本研究仍存在一定的不足。首先，我們的數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的，因此后續(xù)還需要結(jié)合臨床樣本實(shí)施分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。其次，我們通過(guò)生物信息學(xué)挑選出的基因，其作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Sun JH, Zhang HW, Liu HR, Dong YQ and Wang PY conceived and designed the study.Sun JH and Zhang HW performed the experiments.Sun JH, Liu HR and Wang PY analyzed the data.Sun JH and Dong YQ contributed analysis tools.Sun JH and Wang PY provided critical inputs on design,analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.