產(chǎn)前地塞米松暴露對雄性子代大鼠生殖功能的影響

張園園 裴林國

地塞米松為合成類糖皮質(zhì)激素，由于其能夠促進(jìn)胎兒肺的成熟、減少新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、降低圍產(chǎn)兒死亡率被廣泛用于早產(chǎn)相關(guān)妊娠疾病[1]。然而，產(chǎn)前地塞米松暴露對子代而言可能是把雙刃劍，大量研究發(fā)現(xiàn)，它對孕婦和胎兒發(fā)育有明顯的不利影響，潛在的后遺癥包括骨關(guān)節(jié)炎、高血壓、脂肪肝、腎小球硬化、抑郁癥、糖尿病和不孕等[2]。本文建立孕期地塞米松暴露的大鼠模型，探討其雄性子代成年期睪丸的睪酮合成功能及生精功能的變化；以期為闡述機(jī)制提供理論依據(jù)，為解析其對宮內(nèi)環(huán)境的干擾以及子代后天生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生的影響提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用地塞米松治療產(chǎn)前關(guān)疾病治療策略的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（鄭州卓峰制藥，1 mL：2 mg）；大鼠睪酮ELISA試劑盒（bio-techne公司，美國）大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒（江蘇萊爾生物）；3β-羥基固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-hsd）抗體（英國abcam公司）；二抗來自武漢埃博泰克公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑購于大連寶生物公司。

1.2 處理動物及收集標(biāo)本

SD大鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號為110322210100778134，許可證號為SCXK（京）2019-0008。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，于每天6：00pm以雌雄2：1進(jìn)行合籠，第2天上午8：00以陰道分泌物涂玻片，顯微鏡下見到精子者記為孕0 d。受孕大鼠以體質(zhì)量由大到小的序列編號，用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選擇一個(gè)數(shù)字并沿其下方向抄取數(shù)字，體質(zhì)量為偶數(shù)的大鼠放入對照組，體質(zhì)量為奇數(shù)的大鼠放入PDE組，兩組分別為30只孕鼠。從懷孕第10天開始稱體重，每天1次，直到孕20 d結(jié)束。在孕14～18 d期間，PDE組的懷孕大鼠鼠每天皮下注射地塞米松0.4 mg/kg，對照組則給予0.5 mL生理鹽水皮下注射。懷孕20 d時(shí)，隨機(jī)選取懷孕大鼠用剖宮產(chǎn)的方式取胎鼠，選取胎鼠數(shù)8～10只并且雄性胎鼠大于4只的懷孕大鼠納入實(shí)驗(yàn)（n＝8）。每窩所雄性胎鼠血液合并成1管，分離血清。

其他的懷孕大鼠自然分娩，取符合胎鼠數(shù)8～10只并且雄性胎鼠＞4只的懷孕大鼠納入實(shí)驗(yàn)。出生后1周起，每周1次稱量雄性子代鼠的體重，直至第11周（n＝8）。出生后21 d子代鼠斷奶，以后以正常的飲食喂養(yǎng)至出生后90 d。麻醉后斷頸處死大鼠，頸動脈取血并分離血清，冰箱保存；打開腹腔后迅速分離右側(cè)睪丸，利用10%的甲醛溶液固定，12 h后用石蠟包埋；其他的睪丸放置于-40℃冰柜中保存?zhèn)溆茫▌游飳?shí)驗(yàn)流程圖見圖1）。

圖1 動物實(shí)驗(yàn)流程

1.3 檢測血清中激素濃度

采用大鼠睪酮的ELISA試劑盒檢測雄性子代鼠血清中的各種激素濃度：一抗在室溫下孵育1 h后，按照說明書加入待測的血清以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作液，繼續(xù)加入睪酮的結(jié)合液在室溫下孵育3 h，孵育后加入底物在避光環(huán)境下繼續(xù)室溫孵育30 min后加入終止液，利用酶標(biāo)儀分別檢測450 nm和570 nm的吸光度值（A值）來計(jì)算樣本值。

1.4 睪丸總RNA提取及PCR實(shí)時(shí)定量檢測

睪丸組織（每窩取3個(gè)胎睪丸合并一個(gè)樣，成年睪丸夾取組織30 mg），按RNA提取的說明書進(jìn)行，并進(jìn)行cDNA的合成和PCR擴(kuò)增。然后檢測睪丸組織的甾體合成急性調(diào)控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，Star）、P450側(cè)鏈裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，Cyp11a1），3β-hsd的表達(dá)。以標(biāo)準(zhǔn)品相對濃度作為橫坐標(biāo)，各自樣本Ct為縱坐標(biāo)。以2-△△ct計(jì)算基因的表達(dá)水平。

1.5 睪丸熒光檢測

石蠟切片脫蠟，加羊血清室溫環(huán)境下封閉30 min，吸掉封閉液，加一抗4 ℃環(huán)境下孵育過夜；利用PBS洗片3次，加熒光二抗（濃度為1：400），在濕盒中37 ℃孵育1 h，淬滅劑封片溶液進(jìn)行封片。采用日本尼康Eclipse Ci-S直立顯微鏡拍照并進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)。

1.6 精子數(shù)量檢測

在盛有 5 mL Hanks液（保持37 ℃）的培養(yǎng)皿中剪碎附睪尾孵育30 min，進(jìn)行10倍稀釋，在光學(xué)顯微鏡100倍視野下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4個(gè)大方格的精子數(shù)量，重復(fù)計(jì)數(shù)4次取平均值。每毫升液體中的精子數(shù)量＝4個(gè)方格中的精子平均數(shù)量×稀釋倍數(shù)×104。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDE子代雄性大鼠的體重變化

地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性子代大鼠的出生體重為（5.41±0.43）g，低于對照組的（6.00±0.25）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。這種趨勢一直持續(xù)至出生后3周，從出生后第4周開始，地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性子代大鼠的體重追趕上對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 地塞米松產(chǎn)前暴露組與對照組PDE子代雄性大鼠的體重變化比較（g，±s）

表1 地塞米松產(chǎn)前暴露組與對照組PDE子代雄性大鼠的體重變化比較（g，±s）

組別出生0周出生1周出生2周出生3周出生4周出生5周對照組（n＝8）6.00±0.2511.82±0.4623.32±1.5735.14±2.8069.70±5.80116.14±9.46地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）5.41±0.4310.66±1.0320.57±2.6631.12±3.3163.52±6.80110.04±11.37 t值3.5403.1002.6802.7902.0701.240 P值0.0030.0100.0190.0130.0550.230組別出生6周出生7周出生8周出生9周出生10周出生11周對照組（n＝8）148.89±10.66190.93±16.07241.47±16.46279.62±18.79315.64±24.89342.92±27.86地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）141.57±8.27184.49±12.56235.47±17.12273.19±19.65319.61±23.52348.29±21.95 t值1.6300.950 0.7600.710 -0.350-0.450 P值0.1200.3600.4600.4900.7300.660

2.2 PDE子代雄性胎鼠血清的睪酮濃度和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量

與對照組相比，地塞米松產(chǎn)前暴露組的雄性胎鼠血清睪酮明顯降低（P＜0.05），胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量也降低（P＜0.05），見表2。

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睪酮濃度和睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（±s）

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睪酮濃度和睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（±s）

組別胎血睪酮濃度（n＝8，ng/mL）3β-hsd陽性細(xì)胞數(shù)（n＝5，×103）對照組1.78±0.96146.72±15.56地塞米松產(chǎn)前暴露組0.99±0.25123.34±7.95 t值2.2522.994 P值＜0.05＜0.05

2.3 PDE子代雄性胎鼠睪丸甾體激素合成酶的基因表達(dá)

與對照組相比，地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性胎兒大鼠睪丸組織的Star、Cyp11a1、3β-hsd的基因表達(dá)水平均降低，見表3。

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睪丸組織中甾體激素合成酶的基因表達(dá)（±s）

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睪丸組織中甾體激素合成酶的基因表達(dá)（±s）

組別指標(biāo)表達(dá)量t值 P值對照組（n＝8）Star0.68±0.212.453 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）0.36±0.08對照組（n＝8）Cyp11a10.56±0.129.302 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）0.16±0.02對照組（n＝8）3β-hsd1.63±0.354.174 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）0.79±0.45

2.4 PDE子代雄性大鼠的血清睪酮濃度及睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

與對照組相比，地塞米松產(chǎn)前暴露組的雄性成年大鼠的血清睪酮濃度降低（P＜0.01），血清黃體生成素濃度升高（P＜0.05），血清黃體生成素與睪酮的比值升高（P＜0.05）。出生后90 d的雄性大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量為（18.53±3.22）個(gè)，低于對照組的（42.00±5.49）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睪酮濃度和睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（±s）

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睪酮濃度和睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（±s）

組別表達(dá)量t值 P值對照組（n＝8）成年雄性大鼠血睪酮濃度（g/mL）3.56±0.2510.586 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）1.98±0.34對照組（n＝8）成年雄性大鼠血黃體生成素濃度（ng/mL）2.78±0.2611.445 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）4.48±0.33對照組（n＝8）黃體生成素：睪酮0.82±0.246.552＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）2.23±0.56對照組（n＝5）3β-hsd+細(xì)胞數(shù)量（×106）42.00±5.498.251 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝5）18.53±3.22

2.5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸甾體激素合成酶的基因表達(dá)

與對照組相比，地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性成年大鼠睪丸Star和3β-hsd的基因表達(dá)水平降低（P＜0.05），Cyp11a1的表達(dá)水平無變化，見表5。

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸組織甾體激素合成酶的基因表達(dá)（±s）

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸組織甾體激素合成酶的基因表達(dá)（±s）

組別指標(biāo)表達(dá)量t值 P值對照組（n＝8）Star6.48±0.2638.592 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）1.92±0.21對照組（n＝8）Cyp11a18.98±0.232.045 2 ＞0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）8.14±0.36對照組（n＝8）3β-hsd10.25±2.244.851 ＜0.05地塞米松產(chǎn)前暴露組（n＝8）5.19±1.92

2.6 PDE子代雄性大鼠的附睪精子參數(shù)

結(jié)果研究表明，與對照組相比，地塞米松產(chǎn)前地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性成年大鼠附睪尾部精子數(shù)量為（24.21±8.79）個(gè)，低于對照組的（79.24±15.23）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.998，P＜0.01）。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球的早產(chǎn)兒出生率占總新生兒出生率的5%，而早產(chǎn)仍然是新生兒死亡的主要原因[3]。目前，糖皮質(zhì)激素依然是改善早產(chǎn)兒結(jié)局的最重要的治療手段之一，針對孕24～34周并有早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的婦女，臨床建議使用糖皮質(zhì)激素治療[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠中，產(chǎn)前接觸合成類固醇地塞米松（很容易穿過胎盤）或抑制Ⅱ型11β-羥基類固醇脫氫酶的物質(zhì)，出生體質(zhì)量會降低[5-7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，地塞米松產(chǎn)前暴露組雄性子代大鼠的出生體質(zhì)量低于對照組，這種趨勢一直持續(xù)至出生后3周，從出生后第4周開始雄性子代大鼠的體質(zhì)量追趕上對照組。

睪酮是促進(jìn)胎兒包括生殖器的發(fā)育、睪丸下降等器官向雄性方向發(fā)育的主要激素[8]。研究發(fā)現(xiàn)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞是分泌睪酮的主要細(xì)胞，大鼠在胎兒期時(shí)體內(nèi)的睪酮主要由胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞在系列甾體合成酶催化下產(chǎn)生的，而睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分布以及數(shù)量變化能夠影響睪酮的產(chǎn)量[9-10]。本文發(fā)現(xiàn)，地塞米松產(chǎn)前暴露組的胎鼠血清中睪酮濃度降低，同時(shí)胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量降低并伴隨甾體合成酶Star和3β-hsd表達(dá)水平的降低。以上結(jié)果顯示，宮內(nèi)時(shí)期，產(chǎn)前地塞米松暴露的子代大鼠血中睪酮濃度下降與睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量降低和甾體合成酶Star和3β-hsd的基因表達(dá)降低有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)時(shí)期發(fā)育階段雄激素水平缺乏能夠?qū)е鲁赡旰笊诚到y(tǒng)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性增加[11]，并且雄激素能夠促進(jìn)精子的發(fā)生和發(fā)育[12]。在成年時(shí)期，睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的過程主要是由下丘腦-垂體軸分泌的黃體生成素調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前地塞米松暴露的90 d子代雄性大鼠出現(xiàn)了血睪酮濃度的下降，但是血中黃體生成素的濃度卻反饋性的升高；此外，睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少、甾體合成酶Star和3β-hsd的表達(dá)水平下降90 d子代大鼠的附睪精子數(shù)量減少。因此，產(chǎn)前地塞米松暴露的成年后子代大鼠精子數(shù)量減少可能與血中睪酮濃度降低相關(guān)。

研究表明，Star參與了類固醇激素的原料膽固醇由線粒體外膜向內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，它是睪酮合成過程中的重要限速步驟[13-14]。本文發(fā)現(xiàn)，甾體合成酶Star和3β-hsd的基因表達(dá)在宮內(nèi)和出生后成年期的大鼠出現(xiàn)了一致性的表達(dá)降低，而3β-hsd不被認(rèn)為是睪酮合成的限速步驟[15-16]。因此，產(chǎn)前地塞米松暴露所致的Star的表達(dá)降低可能是子代大鼠睪酮水平持續(xù)降低的主要機(jī)制之一。

綜上所述，產(chǎn)前地塞米松暴露能夠?qū)е伦哟笫笤趯m內(nèi)出現(xiàn)血清睪酮濃度降低，并能夠延續(xù)到出生后成年期，同時(shí)還伴隨精子數(shù)量減少，這種現(xiàn)象的發(fā)生可能與宮內(nèi)產(chǎn)前地塞米松暴露所致的甾體酶Star的基因表達(dá)降低有關(guān)。