兩種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)25-羥基維生素D的性能差異及結(jié)果一致性評(píng)價(jià)

常麗 馮蘇 趙東蘭 王超 程麗姍 宋國(guó)威 李立新

當(dāng)前,全球有近十億人普遍存在維生素D不足或者缺乏的情況,維生素D的缺乏是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問(wèn)題。維生素D是維持骨骼健康的主要元素。兒童期維生素D的嚴(yán)重缺乏將導(dǎo)致骨骼畸形,即佝僂病。輕度缺乏將導(dǎo)致食物鈣的利用效率下降[1]。維生素D缺乏將導(dǎo)致肌肉乏力;對(duì)于中老年人,維生素D對(duì)肌肉功能的影響還造成跌倒風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)維生素D可影響200多種不同基因的表達(dá)。維生素D缺乏與糖尿病、不同種類的癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫性疾病有關(guān)[2]。可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)維生素D項(xiàng)目,對(duì)疾病的預(yù)防、診斷及治療具有十分重要的作用。血清 25-羥基維生素 D濃度被認(rèn)為是測(cè)定全面維生素D狀態(tài)的最可靠指標(biāo)[3]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀是臨床常用的診療分析儀器,國(guó)內(nèi)大型醫(yī)院多引進(jìn)國(guó)外進(jìn)口設(shè)備,近年來(lái)我國(guó)醫(yī)改政策不斷調(diào)整,國(guó)產(chǎn)品牌儀器也逐步興起。但不同品牌的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的具體性能存在差異,此研究依據(jù)性能評(píng)價(jià)要求,應(yīng)用新產(chǎn)業(yè)M4000P及羅氏Cobas e411兩種檢測(cè)平臺(tái)作為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口化學(xué)發(fā)光分析儀的代表,檢測(cè)25-羥基維生素D的以下性能指標(biāo): 精密度、 正確度、線性范圍、生物參考區(qū)間,以評(píng)估 2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果能否滿足臨床檢測(cè)需求并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 145例石家莊地區(qū)>60歲的老年人空腹血清,將以上樣本分別在新產(chǎn)業(yè)M4000P和羅氏Cobas e411檢測(cè)平臺(tái)上進(jìn)行分析。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 新產(chǎn)業(yè)M4000P:直接化學(xué)發(fā)光法:試劑名稱:25-羥基維生素 D(25-OH Vitamin D)測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法),批號(hào):1031900301,參考區(qū)間:30～100 ng/ml;質(zhì)控品 level1 10319008011,level210319008012。

1.2.2 羅氏Cobas e411:電化學(xué)發(fā)光法,試劑名稱:25-羥基維生素 D(25-OH Vitamin D)測(cè)定試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法),使用試劑批號(hào):341671,參考區(qū)間:20～32 ng/ml,質(zhì)控品 level1 276842,level2 276843。

1.3 性能驗(yàn)證

1.3.1 精密度驗(yàn)證:依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證》[4],按照與臨床標(biāo)本相同的檢測(cè)方法,2個(gè)濃度的質(zhì)控品,每個(gè)濃度水平同一樣品重復(fù)測(cè)定3次,連續(xù)測(cè)定5 d。判斷標(biāo)準(zhǔn):以國(guó)家衛(wèi)健委室間質(zhì)量評(píng)價(jià)限作為允許總誤差TEa,批內(nèi)精密度<1/4TEa,批間精密度<1/3TEa。

1.3.2 正確度驗(yàn)證:依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T492-2016《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證》[4],按照與臨床標(biāo)本相同的檢測(cè)方法,采用兩個(gè)濃度的工作校準(zhǔn)品,每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)2次,連續(xù)檢測(cè)5 d。單個(gè)項(xiàng)目的偏倚=(檢測(cè)值-靶值)/靶值*100%,平均偏倚=︱偏倚︱的和/5,計(jì)算平均偏倚,平均偏倚<1/2TEa(12.5%)即為該項(xiàng)目驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.3 線性區(qū)間驗(yàn)證:依據(jù)CNAS-GL037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》中6.4線性區(qū)間驗(yàn)證[5],分別選取性能指標(biāo)中線性區(qū)間新產(chǎn)業(yè)線性10～150 ng/ml和羅氏0～30 ng/ml內(nèi)的高值血清標(biāo)本H(標(biāo)本1)和低值血清標(biāo)本L(標(biāo)本5)各1份,并按比例配制標(biāo)本2(3L+1H)、標(biāo)本3(2L+2H)、標(biāo)本4(1L+3H)共5個(gè)濃度系列血清,每個(gè)濃度測(cè)2次,測(cè)得均值與理論值做直線回歸得到Y(jié)=bX+a。b在0.95～1.05范圍內(nèi),r2≥0.95(r≥0.975)可初步判斷線性范圍符合要求。

1.3.4 稀釋倍數(shù)驗(yàn)證:收集接近線性區(qū)間上限的患者血清檢測(cè)3次,按照稀釋倍數(shù)計(jì)算稀釋后的理論值,并按照說(shuō)明書(shū)建議的稀釋倍數(shù)用儀器自動(dòng)稀釋得出實(shí)測(cè)值,同樣重復(fù)檢測(cè)3次,計(jì)算回收率R。如80%≤R≤120%則該稀釋倍數(shù)通過(guò)驗(yàn)證。

1.3.5 參考區(qū)間驗(yàn)證:依據(jù) CLSI C28-A3c[6],選取本院健康體檢中心表觀健康者樣本20例進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證試劑盒給定參考區(qū)間的適用性。判斷標(biāo)準(zhǔn):若20例表觀健康者檢測(cè)結(jié)果≤2例在參考區(qū)間之外,則該參考區(qū)間驗(yàn)證通過(guò);若>2例超出參考區(qū)間之外,則需找出原因重新驗(yàn)證或自行建立參考區(qū)間。

1.4 2種方法檢測(cè)維生素D的結(jié)果一致性評(píng)價(jià) 依據(jù)CLSI EP09-A3文件,采用直接化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)145例血清樣本維生素D,所得結(jié)果采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation efficient,ICC)和Bland-Altman偏差分析法進(jìn)行2組數(shù)據(jù)的一致性評(píng)價(jià)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)組內(nèi)相關(guān)性系數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),如ICC值>0.75,則認(rèn)為2組數(shù)據(jù)一致性良好;采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行Bland-Altman偏差分析,以X±1.96s作為一致性界限。

2 結(jié)果

2.1 2種檢測(cè)平臺(tái)結(jié)果分析

2.1.1 精密度分析:新產(chǎn)業(yè)M4000P、羅氏Cobas e411。見(jiàn)表1。

表1 精密度評(píng)價(jià)表

2.1.2 2種檢測(cè)平臺(tái)正確度評(píng)價(jià):新產(chǎn)業(yè)M4000P、羅氏Cobas e411兩種檢測(cè)平臺(tái)的平均偏倚均<12.5%,正確度驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)表2。

表2 正確度驗(yàn)證

2.1.3 線性區(qū)間驗(yàn)證:選取新產(chǎn)業(yè)M4000P低濃度10.27 ng/ml和高濃度119.55 ng/ml,羅氏Cobas e411低濃度3.05 ng/ml和高濃度67.8 ng/ml,按照0∶4、1∶3、2∶2、3∶1和4∶0的比例稀釋后進(jìn)行線性分析,經(jīng)線性擬合方程為Y=0.99X+0.575,r2=0.9997和Y=0.9969X+0.5523,r2=0.9996。見(jiàn)圖1。

2.1.4 稀釋倍數(shù)驗(yàn)證:新產(chǎn)業(yè)M4000P維生素D線性區(qū)間為10～150 ng/ml,線性區(qū)間足夠大,臨床樣本不涉及稀釋問(wèn)題,故未進(jìn)行稀釋倍數(shù)驗(yàn)證。羅氏Cobas e411維生素D線性區(qū)間0～30 ng/ml,對(duì)其推薦的稀釋倍數(shù)2倍做驗(yàn)證,驗(yàn)證通過(guò),羅氏Cobas e411維生素D臨床可報(bào)告范圍上限到135.54 ng/ml。見(jiàn)表3。

表3 電化學(xué)發(fā)光法驗(yàn)證維生素D稀釋倍數(shù)

2.1.5 兩種檢測(cè)平臺(tái)參考區(qū)間比較:選擇20個(gè)合格的樣本,將檢驗(yàn)結(jié)果與參考區(qū)間比較,超出參考區(qū)間數(shù)據(jù)≤10%,通過(guò)驗(yàn)證;>10%,則分析原因后驗(yàn)證。新產(chǎn)業(yè)M4000P,羅氏Cobas e411均符合標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表4。

表4 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

2.2 2種檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)數(shù)據(jù)一致性分析

2.2.1 組內(nèi)相關(guān)系數(shù):收集的145例石家莊地區(qū)>60歲老年人空腹血清分別用直接化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行維生素D檢測(cè),應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)一致性分析。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),兩種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的VD結(jié)果數(shù)據(jù)間具有顯著相關(guān)性,一致性相關(guān)系數(shù)ICC=0.925,ICC>0.9,提示兩種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)維生素D結(jié)果一致性極好。

2.2.2 Bland-Altman偏差分析:新產(chǎn)業(yè)M4000P的直接化學(xué)發(fā)光法和羅氏Cobas e411電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行維生素D檢測(cè)結(jié)果在收集的檢測(cè)均值偏低范圍(7.65～20 ng/ml)表現(xiàn)出極佳的一致性,在中間偏高范圍(20～60.68 ng/ml)的一致性稍有遜色。隨VD濃度增大,偏差增大的可能性增大。其中有5.5%(8/145)的點(diǎn)在95%的一致性界限(差值的均值±1.96SD)之外,一致性上限以上的點(diǎn)(2個(gè))少于在一致性下限以下的點(diǎn)(6個(gè)),差值絕對(duì)值最大可達(dá)12.52 ng/ml(一致性界限為-6.7～5.18)。2種方法隨VD濃度越大在約>20 ng/ml,偏差增大的可能性越大。見(jiàn)圖2。

圖2 兩種方法檢測(cè)VD的Bland-Altman偏差分析

3 討論

25-羥基維生素D是應(yīng)在血中被檢測(cè)的代謝物,由于它是人體內(nèi)維生素D的主要儲(chǔ)存形式,通過(guò)檢測(cè)它可以確定總維生素D的情況[7,8]。此研究依據(jù)CNAS-GL037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》中的性能驗(yàn)證要求,對(duì)直接化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法25-羥基維生素D檢測(cè)的正確度、精密度、線性范圍和參考區(qū)間等進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果表明25-羥基維生素D性能符合臨床檢測(cè)需求。新產(chǎn)業(yè)M4000P的直接化學(xué)發(fā)光法與羅氏Cobas e411的電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)25-羥基維生素D的正確度即偏倚均滿足1/2TEa要求。25-羥基維生素D直接化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的精密度兩個(gè)水平2.49%和1.63%,電化學(xué)發(fā)光法精密度為5.37%和3.64%,均滿足各自說(shuō)明書(shū)聲明的精密度要求,但德國(guó)羅氏Cobas e411電化學(xué)發(fā)光法在精密度方面表現(xiàn)較國(guó)產(chǎn)新產(chǎn)業(yè)M4000P直接化學(xué)發(fā)光法略差,分析原因由于新產(chǎn)業(yè)M4000P為新裝機(jī),而羅氏Cobas e411使用年限較久導(dǎo)致。直接化學(xué)發(fā)光法的25-羥基維生素D線性區(qū)間為10～150 ng/ml,電化學(xué)發(fā)光法為3～70 ng/ml,經(jīng)驗(yàn)證在其線性區(qū)間范圍內(nèi)線性極好,但二者線性差異較大可能與二者檢測(cè)方法學(xué)不同有關(guān):依據(jù)二者試劑檢測(cè)說(shuō)明書(shū),雖二者檢測(cè)均為免疫競(jìng)爭(zhēng)法,但兩個(gè)檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)原理不同,其所制備抗體、相應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)及所依托的反應(yīng)體系技術(shù)也不同,導(dǎo)致該檢測(cè)項(xiàng)目的線性區(qū)間有較大差異。由于直接化學(xué)發(fā)光法線性區(qū)間足夠大,臨床樣本很少涉及稀釋,因此只對(duì)電化學(xué)發(fā)光法的25-羥基維生素D做了稀釋倍數(shù)驗(yàn)證,驗(yàn)證后檢測(cè)范圍和直接化學(xué)發(fā)光法接近。

2種方法的參考區(qū)間隨差距較大,但也驗(yàn)證通過(guò),推測(cè)可能同樣由于方法學(xué)體系的差異產(chǎn)生。本研究組內(nèi)相關(guān)系數(shù)ICC達(dá)到了0.925,表現(xiàn)出極好的一致性,與兩種方法溯源一致有關(guān):新產(chǎn)業(yè)M4000P的25-羥基維生素D校準(zhǔn)品溯源為美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM972a,而羅氏Cobas e411的25-羥基維生素D可溯源至LC-MS/MS,并可進(jìn)一步溯源至NIST標(biāo)準(zhǔn)。2種方法的Bland-Altman偏差分析顯示出在檢測(cè)均值偏低范圍(7.65～20 ng/ml)結(jié)果的一致性更好,隨VD檢測(cè)值增大約>20 ng/ml,偏差增大的可能性增大。這與譚延國(guó)[9]對(duì)不同化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)生長(zhǎng)激素的一致性研究基本一致,結(jié)果顯示隨生長(zhǎng)激素水平遞增,不同方法的檢測(cè)系統(tǒng)間的水平差異夜呈比例遞增。

基于各臨床實(shí)驗(yàn)室出具的25-羥基維生素D報(bào)告單中,同一檢測(cè)樣本涉及到使用的不同方法學(xué)的檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果可能會(huì)有所差異,為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可比性,應(yīng)在報(bào)告單上備注所使用的檢測(cè)方法學(xué),以便于不同方法學(xué)的檢驗(yàn)結(jié)果的分析。而對(duì)有方法學(xué)差異的檢測(cè)項(xiàng)目,實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)及檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)工作也是基于相同檢測(cè)方法、相同檢測(cè)儀器甚至是相同試劑,因此對(duì)于同一檢驗(yàn)項(xiàng)目有不同檢驗(yàn)方法的情況應(yīng)依據(jù)各臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的具體情況綜合分析。