IGF-1、IL-10在人膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中的表達意義

陳城 王永成 王璽 王長海

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種進行性關(guān)節(jié)退行性疾病,其特點是關(guān)節(jié)軟骨的損害、關(guān)節(jié)軟骨緩慢進行性丟失、骨刺形成等[1]。一些被認為導致骨性關(guān)節(jié)炎的常見因素包括高齡、肥胖、女性性別、遺傳易感性、機械應(yīng)激和創(chuàng)傷等[2]。預(yù)計隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加,OA的患病率也在逐漸增加。隨著世界人口老齡化和肥胖的日益加劇,骨關(guān)節(jié)炎的健康服務(wù)將受到更高的需求,且我國人口眾多,人口老齡化嚴重,其對社會經(jīng)濟的影響越來越大,并且這種疾病是不可逆轉(zhuǎn)的,雖然 OA 通常被稱為一種伴有軟骨損傷和喪失的關(guān)節(jié)疾病,但 OA 是一種多樣化的疾病,其發(fā)病機制復(fù)雜,影響關(guān)節(jié)內(nèi)的所有組織[3]。OA 發(fā)病機制中最重要的因素之一是細胞因子平衡紊亂,細胞因子在OA中的作用可分為炎性作用和抗炎作用[4]。OA發(fā)生的病理生理過程主要由炎性細胞因子,如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-23等介質(zhì)介導,從而增強分解代謝[5]。同時,抗炎細胞因子也會調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),保護關(guān)節(jié)組織。IGF-1、IL-10分別可通過多種途徑介導阻止骨關(guān)節(jié)炎的進展,保護關(guān)節(jié)軟骨。隨著對OA病因和發(fā)病機制認識的提高,越來越多的潛在靶點被用于預(yù)防疾病的發(fā)展和進展?；诖?本研究通過觀察胰島素生長因子1(IGF-1)、白介素-10(IL-10)在人KOA患者關(guān)節(jié)軟骨中的表達水平,分析兩者與疾病嚴重程度及兩者之間的關(guān)系,為臨床提供理論依據(jù)和探索有效治療方法,以期減緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗組:收集2020年9月至2021年12月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院因原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的標本組織,在股骨髁或脛骨平臺軟骨處取大小為1.0 cm × 1.0 cm × 0.8 cm組織標本,其中男16例,女21例;年齡56～85歲,平均年齡(69.6±8.03)歲。對照組:收集4例意外傷亡及外傷性截肢的青年患者,正常膝關(guān)節(jié)。年齡25～33歲,平均年齡(28.3±3.57)歲。診斷標準參考中華醫(yī)學會骨科學分會關(guān)節(jié)外科組等專業(yè)委員會制定的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2021版)[6]。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①符合膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)診斷標準;②患者均符合手術(shù)指征,且均同意行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù);③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,患者及家屬均知情同意;④臨床資料完整。

1.2.2 排除標準:患者均收集病史,術(shù)前均行影像學檢查及術(shù)后大體標本檢查,排除類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)、感染性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核性關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)周圍腫瘤等。

1.3 病理學Mankin評分 Mankin評分[7]是對OA軟骨退行性改變程度評價的通用標準,總分14分,分數(shù)越高說明關(guān)節(jié)軟骨損傷越重。見表1。

表1 關(guān)節(jié)軟骨退變的Mankin評分標準

1.4 方法 將實驗標本進行HE染色、翻紅O/固綠染色及免疫組化染色。HE染色,番紅O/固綠染色可以顯示軟骨結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、基質(zhì)染色情況和潮線有無復(fù)制,是否完整。本實驗采用雙盲法,并通過HE染色,番紅O/固綠染色參照評分標準對OA軟骨退行性改變進行評分分組,分組:正常組:0～2分;輕度組:3～7分;中度組:8～10分;重度組:11～14分。將2組通過免疫組化法觀察IGF-1、IL-10在各組標本中的表達,探究IGF-1、IL-10在正常膝關(guān)節(jié)及OA各期關(guān)節(jié)軟骨中的表達是否與它們的病程進展有統(tǒng)計學意義。

1.5 結(jié)果判定 2組免疫組化法觀察IGF-1、IL-10在各組標本中的表達,采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件進行半定量分析,判定IGF-1和IL-10在人膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中的表達與骨關(guān)節(jié)炎病程的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 翻紅O/固綠染色結(jié)果 對照組軟骨細胞排列清晰、整齊,軟骨基質(zhì)紅染。輕度組軟骨表層粗糙,軟骨出現(xiàn)潮線復(fù)制前移,但未越過潮線。中度組軟骨出現(xiàn)微裂隙,甚至達到軟骨下骨,可見軟骨細胞肥大、增殖及簇集。重度組可見軟骨全層缺失,軟骨下骨裸露,象牙化。見圖1～4。

圖1 對照組 (×100) 圖2 輕度組(×100) 圖3 中度組 (×100) 圖4 重度組(×100)

2.2 關(guān)節(jié)軟骨免疫組化染色結(jié)果 鏡下:實驗組與對照組中都有表達,表達部位多位于細胞質(zhì)及細胞間質(zhì),隨著KOA病程進展,IL-1β、IL-4、IGF-1和IL-10表達逐漸降低,棕色逐漸變少,隨著KOA病程進展。IL-1β、IL-4、IGF-1和IL-10表達逐漸降低,棕色逐漸變少。見圖5、6。

圖5 IGF-1表達(HE×100)

圖6 IL-10表達(HE×100)

2.3 患者一般情況 根據(jù)Manklin病理標準評分將結(jié)果分為正常對照組4例,輕度組7例,中度組13例,重度組17例。各組KOA患者與對照組年齡、性別比、BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組KOA患者和對照組基本資料

2.4 Mankin組織學評分 對照組評分最低,關(guān)節(jié)軟骨損傷最低,重度組評分最高,關(guān)節(jié)軟骨損傷最重,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組關(guān)節(jié)軟骨Mankin組織學評分 分,

2.5 4組IGF-1和IL-10表達水平比較 與對照組相比,輕、中、重度KOA組關(guān)節(jié)軟骨IGF-1和IL-10表達水平均降低,且隨著KOA患者臨床分期的進展IGF-1和IL-10呈下降趨勢,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中輕度組、中度組、重度組均低于對照組。見表4。

表4 IGF-1和IL-10表達水平比較

2.6 IGF-1和IL-10平均光密度與Mankin評分相關(guān)性 將各組IGF-1 、IL-10平均光密度與Mankin評分進行相關(guān)性分析,Pearson相關(guān)系數(shù)R=-0.635、-0.770,均P<0.001。關(guān)節(jié)軟骨中IGF-1 、IL-10的表達均與骨關(guān)節(jié)炎的嚴重程度呈負相關(guān)。見圖7、8。

圖7 IGF-1與Mankin評分相關(guān)性

圖8 IGF-1與Mankin評分相關(guān)性

3 討論

IGF-1是生長因子家族中的一員,在結(jié)構(gòu)上與前胰島素密切相關(guān),在軟骨修復(fù)過程中對軟骨細胞的生物學行為有著深遠的影響,并從根本上調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)代謝,可促進軟骨細胞增殖、增強基質(zhì)生成和抑制軟骨細胞凋亡[8]。IGF-1通常位于軟骨細胞周圍的局部基質(zhì)中,在那里它以相對恒定的水平存在,并向細胞發(fā)出信號,以增加合成代謝活性和基質(zhì)分子的產(chǎn)生[9]。體外研究表明,胎牛血清中的IGF-1負責維持關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖的合成,由此可見IGF-1在促進關(guān)節(jié)軟骨再生方面具有很大潛力[10]。體內(nèi)實驗也有類似結(jié)果,在大鼠骨折模型中,IGF-1關(guān)節(jié)腔注射可在第5天早期刺激軟骨細胞增殖和軟骨形成[11]。另外一項對大鼠的動物研究證實,IGF-1 的持續(xù)減少會導致軟骨損傷[12]?？梢奍GF-1對維持軟骨的完整性至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)IGF-1在對照組中的表達高于各試驗組,且隨著OA病程進展IGF-1表達逐漸降低,說明IGF-1在人膝骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用。當OA發(fā)生的時候,炎性因子會刺激軟骨基質(zhì)的降解(尤其是II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖會被降解)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的產(chǎn)生[13,14]。有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1可通過阻止MMP-13的表達并在體外增強 TIMPs(TIMPs不僅能阻止活化的MMPs[15];而且還能抑制和延緩MMPs酶原型轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚灶愋偷谋磉_來免受炎性因子介導的軟骨細胞破壞,還能抑制炎性介質(zhì)的進展[16],這可能是IGF-1在OA中發(fā)揮保護性作用的其中一種機制。

IL-10是一種以抗炎活性聞名的由多種免疫細胞產(chǎn)生的合成代謝刺激細胞因子。在健康的關(guān)節(jié)中,IL-10及其受體IL-10R存在于多個關(guān)節(jié)組織中,在OA中,軟骨細胞會表達更多的IL-10及其受體[17,18]。研究表明IL-10與骨關(guān)節(jié)疾病相關(guān),例如IL-10可通過核因子-kappa B (RANK)/RANK配體(RANKL)/骨保護素(OPG)軸受體激活因子影響破骨細胞和成骨細胞增殖,參與維持骨代謝平衡,由此可見IL-10與骨代謝疾病密切相關(guān)[19,20]。Sun等[21]的研究中還發(fā)現(xiàn)骨折愈合正常的患者中,外周血中表達IL -10的B細胞數(shù)量明顯高于愈合延遲或骨不連的患者。小鼠骨折模型研究表明,當過表達IL-10的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)轉(zhuǎn)譯到小鼠股骨骨折部位時,IL-10顯著抑制骨折誘導的急性炎性反應(yīng),促進骨形成[22]。這也體現(xiàn)了IL-10可增強成骨細胞分化,促進骨折愈合。IL-10還可顯著拮抗TNF-α誘導的IL-6、MMP-1和MMP-3的表達[23],增加軟骨細胞形成標志物Col II、SOX9、糖胺聚糖的表達。此外,IL-10還可抑制軟骨細胞凋亡,調(diào)節(jié)軟骨細胞的炎性反應(yīng),從而減輕關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)引起的不良結(jié)局[24,25]。同樣本研究也發(fā)現(xiàn)了IL-10在對照組中的表達高于各試驗組,且隨著OA病程進展其表達逐漸降低,表明IL-10在人膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用也不可忽視。

IGF-1、IL-10在OA中的作用是一種保護性的作用。本研究采用免疫組化法檢測IGF-1、IL-10在人KOA中不同病程關(guān)節(jié)軟骨中的表達,發(fā)現(xiàn)正常軟骨中表達量均高于KOA退變軟骨的表達量,且隨著OA嚴重程度的加重而逐漸降低,IGF-1、IL-10的表達與OA嚴重程度呈負相關(guān),表明IGF-1、IL-10是骨關(guān)節(jié)炎的保護性細胞因子,提示IGF-1、IL-10可作為判定骨關(guān)節(jié)炎炎性病變的重要依據(jù),還可能為將來治療骨關(guān)節(jié)炎提供精確的靶點。在以往的研究中,IGF-1、IL-10在骨關(guān)節(jié)炎中的作用研究大多采用的是動物實驗?zāi)Ｐ?而本研究收集了我院原發(fā)性膝關(guān)節(jié)炎患者標本,在人身上證實了IGF-1、IL-10是骨關(guān)節(jié)炎的保護性細胞因子這一結(jié)論。另外,IL-10、IGF都可以抑制炎性因子IL-1β誘導軟骨基質(zhì)減少的能力以及下調(diào)MMPs表達水平,抑制炎性反應(yīng)及關(guān)節(jié)軟骨細胞的溶解,促進軟骨細胞蛋白聚糖及膠原的合成,還可以抑制炎性因子的表達,從而保護關(guān)節(jié)軟骨,延緩OA的進程[14,22],可以猜想IGF-1、IL-10兩種因子之間可能有某種協(xié)同作用或者通過某種途徑相互促進,共同抑制炎癥、維護關(guān)節(jié)軟骨,減輕關(guān)節(jié)炎的進展,其分子機制之間的變化尚不清楚。因此在與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的細胞因子整體觀念的影響下,仍需仔細研究和探討,將為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路及更廣闊的前景。