氫溴酸山莨菪堿對(duì)感染性休克大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

夏葦 劉偉鳳 張琦

膿毒癥在重癥監(jiān)護(hù)室中發(fā)病率和死亡率居高不下,其嚴(yán)重形式——感染性休克可導(dǎo)致高達(dá)60%的死亡率[1]。據(jù)報(bào)道,全球每年有超過(guò)1 900萬(wàn)膿毒癥患者,其中600萬(wàn)患者死亡,病死率超過(guò)1/4[2]。膿毒癥的治療不僅占用大量的醫(yī)療資源,同時(shí)給社會(huì)和個(gè)人造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。事實(shí)上,感染性休克引起的炎性反應(yīng)失控是膿毒癥高死亡率的主要原因之一。在膿毒癥期間,為了應(yīng)對(duì)感染和危險(xiǎn)信號(hào),炎性介質(zhì)的產(chǎn)生不受控制,從而誘導(dǎo)有害的免疫反應(yīng),最終導(dǎo)致多器官功能障礙[3]。值得注意的是,肺是最常見和最脆弱的器官之一,主要表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸道疾病窘迫綜合征[4]。具體而言,ALI是一種嚴(yán)重的炎性肺病,其特征是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性介質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生、肺泡損傷,以及細(xì)胞因子積累,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征。因此,改善失調(diào)的炎性反應(yīng)是實(shí)現(xiàn)ALI成功治療的重要策略。氫溴酸山莨菪堿(C17H23NO4·HBr,Ani HBr)即山莨菪堿,是1956年從中國(guó)特產(chǎn)植物山莨菪根中提取的活性成分,常用于治療胃腸痙攣和有機(jī)磷農(nóng)藥中毒[5]。研究報(bào)道,山莨菪堿具有顯著的抗炎作用,能夠抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡,對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用[6]。另外,山莨菪堿可抑制急性腎損傷和胰腺腺泡細(xì)胞損傷中的炎性反應(yīng)[7,8]。然而,其在ALI進(jìn)展中的作用仍有待研究。因此,本研究旨在探討Ani HBr在感染性休克大鼠急性肺損傷中的作用,并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究Ani HBr對(duì)受損大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡和炎性過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)雄性SD大鼠(8～10周齡),體重250～300 g,購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SYXK(滬)2018-0028。每籠5只大鼠,自由飲食飲水,室溫(21～23℃),濕度(30%～70%),12 h光照/12 h黑暗。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并完全遵循《國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用指南》。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 氫溴酸山莨菪堿注射液購(gòu)自長(zhǎng)春長(zhǎng)慶藥業(yè)集團(tuán)有限公司;脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;鼠L-1β、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;Bcl2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、NF-κB p65抗體、NLRP3抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗均購(gòu)自abcam公司;GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。梅特勒托利多精密天平(PL-IC,蘇州賽恩斯),自動(dòng)組織處理機(jī)(TP1020,德國(guó)徠卡),Bio-Rad凝膠成像分析儀(ChemiDocTM,美國(guó)伯樂(lè)),多功能酶標(biāo)儀(VarioskanTMLUX,美國(guó)賽默飛)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與分組:將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(LPS)以及Ani HBr治療組(LPS+Ani HBr),每組10只。隨后,按照Tian等[9]的方法,建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的感染性休克大鼠急性肺損傷模型。具體操作:SD大鼠禁食12 h后,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠,割開頸部,暴露氣管。待血壓穩(wěn)定后,LPS+Ani HBr組通過(guò)1 ml注射器沿氣管壁插入氣管內(nèi),注入15 mg/kg LPS,隨后立即腹腔注射3.6 mg/kg的Ani HBr;LPS組通過(guò)氣管管道注入15 mg/kg LPS后,按上述操作注射等體積的0.9%氯化鈉溶液;Sham組不做任何處理。

1.3.2 樣本收集:給藥處理6 h后,麻醉處死大鼠,用預(yù)冷的PBS通過(guò)氣管插管沖洗肺3次。灌洗液經(jīng)1 500 r/min離心10 min,收集上清液,即支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。BALF在-4℃中保存待用。隨后,將40～50 μg肺組織置于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3.3 確定肺系數(shù)、濕/干重比及組織含水量 實(shí)驗(yàn)前大鼠稱重并記錄。實(shí)驗(yàn)后,取大鼠右側(cè)肺組織,用吸水紙去除表面水分,稱重并記為濕重,計(jì)算肺組織系數(shù)。隨后將肺組織置于60℃烘箱中,連續(xù)干燥72 h直至組織重量保持不變,稱重并記為干重,計(jì)算肺組織濕/干重(W/D)比及肺組織含水量。肺組織系數(shù)=濕重/體重×100%,肺組織含水量=(1-干重/濕重)×100%。

1.3.4 肺組織病理學(xué)觀察:取左肺上葉部分組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h,脫水后石蠟包埋,切片厚度5 μm,最后蘇木素-伊紅染色觀察病理變化。肺組織損傷由專業(yè)病理學(xué)家在雙盲條件下根據(jù)肺泡腔結(jié)構(gòu)完整性、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等情況進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)肺組織損害,0分;肺組織損害范圍<25%,1分;肺組織損害范圍20%～50%,2分;肺組織損害范圍51%～75%,3分;肺組織損害范圍>75%,4分。取每個(gè)病理切片的4個(gè)不同視野進(jìn)行評(píng)分,并對(duì)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 BALF中炎性相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測(cè):按照ELISA試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6及TNF-α濃度。以空白孔調(diào)零,多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.3.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及NF-κB/NLRP3通路的活性:取左肺下葉組織置于RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑中,冰上裂解30 min。 4℃,12 000 r/min,離心10 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,-20℃儲(chǔ)存。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,用0.22 μm PVDF膜濕轉(zhuǎn)90 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將膜用5%(w/v)的BSA室溫下封閉1.5 h,隨后與TBST稀釋的特異性一抗4℃孵育過(guò)夜。一抗包括Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Caspase-3(1∶200)、NF-κB p65(1∶200)、NLRP3(1∶500)、和GAPDH(1∶2 000)。將膜用TBST洗滌30 min后,在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)孵育2 h,用TBST洗滌15 min。ECL發(fā)光試劑顯色蛋白質(zhì)帶,最后用ImageJ軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Ani HBr降低肺系數(shù)、肺組織W/D比以及肺組織含水量 Sham組肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(0.73±0.23)%,(6.12±0.22和(80.12±1.85)%;LPS組肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(1.19±0.11)%,8.61±0.61和(85.71±0.43)%。與Sham組比較,LPS組大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量明顯升高(均P<0.05)。在給予Ani HBr處理后肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(0.75±0.03)%,(6.02±0.17)和(79.88±1.05)%,與LPS組比較,LPS+Ani HBr(3.6 mg/kg)組大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量顯著降低(均P<0.05)。這提示Ani HBr能夠降低感染性休克大鼠急性肺損傷中的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量。

2.2 Ani HBr改善感染性休克大鼠肺組織病理改變 與Sham組比較,LPS組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡腔及間隔內(nèi)大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔增寬,肺泡腔受壓塌陷。LPS+Ani HBr組肺組織出現(xiàn)與LPS組相似的病理改變,但嚴(yán)重程度相對(duì)較輕。隨后對(duì)各組大鼠進(jìn)行肺組織形態(tài)學(xué)病理評(píng)分。LPS組病理評(píng)分明顯高于Sham組(P<0.01)。LPS+Ani HBr組病理評(píng)分明顯低于LPS組(P<0.05)。見圖1,表1。

表1 3組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分比較 n=10,

圖1 3組大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)比較(50 μm,HE×100)

2.3 3組大鼠BALF中IL-1β、IL-6以及TNF-α水平比較 3組大鼠BALF中IL-1β與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6及TNF-α含量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);而經(jīng)Ani HBr治療后,感染性休克大鼠肺組織中的促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量明顯降低(均P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明Ani HBr能夠抑制感染性休克大鼠肺組織中炎性反應(yīng)。見表2。

表2 3組大鼠BALF中炎性因子表達(dá)水平比較 n=10,

2.4 3組大鼠肺組織中Bcl2、Bax以及Caspase-3 等凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Bcl2具有抗凋亡作用,而Bax和Caspase-3具有促凋亡作用。Western blot結(jié)果顯示,與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中Bcl2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),而Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而經(jīng)Ani HBr治療后,感染性休克大鼠肺組織中的Bcl2蛋白表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3,圖2。

表3 3組大鼠肺組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 n=10,

圖2 3組大鼠肺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平;A 凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平;B NF-κB和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.5 3組大鼠肺組織中NF-κB p65和 NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 采用Western blot法檢測(cè)3組大鼠肺組織中NF-κB p65和NLRP3 蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。這提示LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷與NF-κB/NLRP3通路密切相關(guān),LPS能夠激活NF-κB/NLRP3信號(hào)通路。另外,與LPS組比較,經(jīng)Ani HBr治療后,大鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3蛋白表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);說(shuō)明Ani HBr在感染性休克大鼠模型中發(fā)揮肺保護(hù)作用,在機(jī)制上與NF-κB/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)。見表4,圖2。

表4 3組大鼠肺組織中NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)情況比較 n=10,

3 討論

膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是感染性休克疾病最常見的死亡原因之一。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,其誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致ALI的重要致病因素,其氣管給藥方式在動(dòng)物模型中應(yīng)用廣泛[10]。本研究中,我們建立了LPS誘導(dǎo)的急性大鼠肺損傷模型,以研究Ani HBr對(duì)感染性休克大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及潛在的分子機(jī)制。

肺系數(shù)能夠指示肺組織損傷的嚴(yán)重程度,肺組織W/D比是肺血管通透性的重要指標(biāo)之一,而肺組織含水量能夠評(píng)估肺水腫程度。因此,肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水常用來(lái)表征感染性休克大鼠的肺功能[11]。我們的結(jié)果顯示,LPS刺激后大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量均顯著升高;相反,經(jīng)Ani HBr處理后,受損大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量均顯著降低,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。因此,Ani HBr能夠減輕受損大鼠的肺組織損傷,提高肺血管通透性和減少肺水腫,對(duì)LPS誘導(dǎo)的感染性休克大鼠肺損傷具有積極的保護(hù)作用。研究表明,Ani HBr 能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮著保護(hù)細(xì)胞的作用[12]。因此,在本研究中我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,如抗凋亡蛋白Bcl2和凋亡蛋白Bax和Caspase 3。結(jié)果顯示,經(jīng)Ani HBr處理后凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)明顯下調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2的含量顯著上調(diào),這表明Ani HBr在LPS誘導(dǎo)的肺損傷大鼠中具有抑制凋亡通路的作用,即Ani HBr能夠減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

既往研究表明,炎性是ALI的重要發(fā)病機(jī)制[12,13]。白細(xì)胞,特別是中性粒細(xì)胞在肺間質(zhì)和肺泡腔的浸潤(rùn)和積聚是ALI最重要的病理標(biāo)志之一[14]。雖然中性粒細(xì)胞從循環(huán)中快速、適量地流入肺部對(duì)于清除肺泡腔內(nèi)的微生物病原體和其他有害物質(zhì)至關(guān)重要,但中性粒細(xì)胞的過(guò)度聚集可能會(huì)釋放毒性介質(zhì),如促炎細(xì)胞因子,它們是啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和加速病理變化的重要原因[15]。HE染色顯示,與Sham組比較,LPS組的肺泡腔及間隔內(nèi)出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。然而,與LPS組比較,經(jīng)Ani HBr處理后受損大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整性得到明顯改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。另外,我們通過(guò)ELISA法檢測(cè)了受損大鼠BALF中相關(guān)促炎因子(IL-1β、IL-6 和 TNF-α)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與Sham組比較,LPS處理能夠?qū)е率軗p大鼠BALF中IL-1β、IL-6 和 TNF-α表達(dá)顯著增加,而經(jīng)過(guò)Ani HBr干預(yù)后LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明,Ani HBr通過(guò)介導(dǎo)一系列的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng),減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。值得注意的是,炎性小體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)在膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷中發(fā)揮著重要作用,抑制NLRP3激活對(duì)膿毒癥所致的ALI具有積極的治療效果[16]。另外,核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是介導(dǎo)炎性和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子,其中p65是NF-κB異源二聚體的一個(gè)重要亞基。研究顯示,在革蘭陰性桿菌誘導(dǎo)的膿毒癥中,LPS能夠促進(jìn)NF-κB p65的活化,進(jìn)而上調(diào)NLRP3,從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[17]。因此,我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NF-κB p65和NLRP3的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,LPS能夠激活NF-κB/NLRP3 通路,而經(jīng)Ani HBr處理后明顯降低NF-κB和NLRP3蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明,Ani HBr通過(guò)抑制NF-κB/NLRP3通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是發(fā)揮肺保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一,進(jìn)一步解釋了其治療ALI的潛力。

總之,本研究證實(shí)了Ani HBr能夠明顯降低肺系數(shù)、肺組織濕/干重比以及肺組織含水量;維持受損大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的完整性,減少細(xì)胞凋亡;同時(shí),降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表達(dá)。本研究表明Ani HBr對(duì)感染性休克大鼠急性肺損傷具明顯的保護(hù)作用,可能與抑制炎性反應(yīng)相關(guān),其機(jī)制或許與NF-κB/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)。