止瀉靈糖漿質(zhì)量標準提升及特征圖譜研究

閔建國 黃美仙 戴 航 周艷林 李江旗

1.桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；3.桂林市政務服務中心，廣西 桂林 541100

止瀉靈糖漿收載于衛(wèi)生部藥品標準《中藥成方制劑》第十冊[1]，處方由五倍子、雞矢藤、車前草、陳皮、地膽草、兒茶、萊菔子、白術(shù)、伏龍肝、黨參和滑石粉等11味藥組成，被廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局認定為民族藥。其具有健脾、清熱利濕、澀腸止瀉之功，臨床上用于治療急性腸炎、小兒消化不良、單純性腹瀉等，具有較好療效。該品種處方藥味藥性平和，無虎狼藥味，較適用于兒童相應病癥的治療。該品種現(xiàn)行質(zhì)量標準比較粗放，僅有2項顏色反應鑒別項，缺乏處方藥材專屬性鑒別和含量測定等定量控制指標，難以保證藥品的質(zhì)量和療效穩(wěn)定性，尚未見止瀉靈糖漿質(zhì)量標準的研究報道。為了更好地控制止瀉靈糖漿的質(zhì)量，借助薄層色譜法(TLC)對其方中五倍子、陳皮進行鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測定成品中橙皮苷的含量，并建立其乙酸乙酯部位特征圖譜，可為止瀉靈糖漿質(zhì)量標準提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(含Waters 2996二極管距陣檢測儀，Empower 2色譜工作站)；Waters symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；卡瑪ATS4薄層色譜自動點樣儀(瑞士)；卡瑪TV2薄層色譜成像儀(瑞士)；BEG-60離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥 沒食子酸對照品(批號121261-201303，純度：99.7%)、橙皮苷(批號：110721-201818，純度：96.2%)、陳皮對照藥材(批號：121261-201303)均購自中國食品藥品檢定研究院。止瀉靈糖漿樣品(批號：170923、170926、171203、171206、180502、180901、181101、181102、190301、190302、191101、200301)、缺五倍子陰性和缺陳皮陰性樣品均由桂林三金藥業(yè)股份有限公司按處方制備；乙腈、甲醇(色譜純)；冰醋酸(分析純)，液相用水為超純水，其余化學試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 五倍子[2]68[3]取止瀉靈糖漿5 mL，置于15 mL的離心管，加乙酸乙酯5 mL，振搖提取后離心(5 min，3000 rpm)，吸取上清液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各10～15 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果顯示陰性無干擾。如圖1所示。

1.缺五倍子陰性樣品；2.沒食子酸對照品；3～5.止瀉靈糖漿 (批號：170623、170626、181101)圖1 五倍子薄層色譜圖

2.1.2 陳皮[2]199[4-5]取止瀉靈糖漿3 mL，置于 15 mL 離心管，加水2 mL和乙酸乙酯-正丁醇(1∶1)混合液2 mL，振搖提取后離心(5 min，3000 rpm)，吸取上清液1 mL，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各2～5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上使成條帶狀，以三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，于紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果顯示陰性無干擾。如圖2所示。

1.缺陳皮陰性樣品；2.陳皮對照藥材；3～5.止瀉靈糖漿供試品(批號：170623、170626、181101)圖2 陳皮薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters symmetry C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇-6%冰醋酸水溶液(35∶65)；檢測波長：283 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。色譜圖見圖3。

1.橙皮苷；a.橙皮苷對照品溶液；b.供試品溶液；c.缺陳皮陰性樣品液；d.甲醇空白樣液圖3 止瀉靈糖漿高效液相色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品19.83 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液；精密吸取對照品儲備溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取止瀉靈糖漿2 mL，加水2 mL，搖勻后加水飽和正丁醇溶液振搖提取3次，每次5 mL，振搖后離心(5 min，3000 rpm)，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用適量甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 缺陳皮陰性樣品溶液制備 取缺陳皮的陰性樣品2 mL，按2.2.3 項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 線性關(guān)系考察 取2.2.2項下對照品溶液，精密吸取橙皮苷對照品儲備溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。以橙皮苷的量為橫坐標(X)，橙皮苷峰的峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=1.83×106X+1.34×103，r=0.9999。結(jié)果表明，橙皮苷進樣量在0.190765～3.815292 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5.2 精密度試驗 取止瀉靈糖漿(批號：181101)2 mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定 6 次，計算橙皮苷的含量。6次測定結(jié)果的平均值為0.341 mg/mL，RSD為0.25%(n=6)。結(jié)果表明方法精密度良好。

2.2.5.3 重復性實驗 取止瀉靈糖漿(批號：181101)2 mL，共6份，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件測定橙皮苷含量，6份樣品中橙皮苷的平均含量為0.336 mg/mL，RSD為1.42%(n=6)。結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5.4 穩(wěn)定性實驗 取2.2.5.3項下同一份供試品溶液，分別于制備后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進樣測定，6次測定結(jié)果的平均值為0.340 mg/mL，RSD為1.89%(n=6)。結(jié)果表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5.5 加樣回收率試驗 精密移取重現(xiàn)性試驗同一批號樣品1 mL，共6份，分別精密加入橙皮苷對照品儲備溶液1 mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件測定橙皮苷含量，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。加樣回收試驗結(jié)果顯示：平均回收率101.63%，RSD為0.77%(n=6)，表明方法的準確度良好。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.2.5.6 樣品測定 取12批次止瀉靈糖漿，按“2.2.3”和“2.2.1”項下方法處理、測定，計算橙皮苷含量。結(jié)果見表2。

表2 12批次止瀉靈糖漿樣品橙皮苷的含量測定結(jié)果

2.3 特征圖譜[6-7]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相為乙腈(A)-6%冰醋酸水溶液(B)體系，洗脫梯度：0～30 min；A：15%～30%，30～60 min；A：30%～60%；進樣量為20 μL；其他同含量測定項。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)以橙皮苷計，不低于7000，分離度大于1.5。

2.3.2 供試品溶液制備 精密移取7 mL止瀉靈糖漿置于離心管中，加乙酸乙酯 5 mL，搖勻后離心，取上清液，重復操作3次，合并乙酸乙酯，蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，濾過，即得。

2.3.3 方法考察

2.3.3.1 精密度試驗 取止瀉靈糖漿(170923)按2.3.2項和2.3.1項制備供試品溶液并測定，連續(xù)測定6次。以2號峰(橙皮苷)為參照峰，各特征峰的相對峰面積波動RSD小于0.48%，相對保留時間波動RSD小于0.27%，表明該方法的精密度良好。

2.3.3.2 重復性試驗 取止瀉靈糖漿(170923)6份，按2.3.2項和2.3.1項制備供試品溶液并測定。以2號峰(橙皮苷)為參照峰，各特征峰的相對峰面積波動RSD小于1.24%，相對保留時間波動RSD小于0.41%，表明該方法的重復性良好。

2.3.3.3 中間精密度試驗 取2.3.3.2項6份供試品，按2.3.1項方法于賽默飛U3000型液相儀測定，以2號峰(橙皮苷)為參照峰，各特征峰的相對峰面積波動RSD小于0.95%，相對保留時間波動RSD小于0.62%。測定結(jié)果與重復性考察所用waterse2695型液相儀測定結(jié)果比較，不同儀器間各特征峰相對峰面積波動RSD范圍是0.3%～4.7%，相對保留時間波動RSD范圍是0.2%～2.9%，表明該方法的于不同儀器設備上的重現(xiàn)性良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗取 2.3.3.1項供試品溶液，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h按2.3.1項方法測定，以2號峰(橙皮苷)為參照峰，各特征峰的峰面積波動RSD小于2.55%，相對保留時間波動RSD小于1.93%，表明該方法的重復性良好。

2.3.4 對照特征圖譜的生成 取各批次止瀉靈糖漿，按2.3.2項制備供試品溶液，并按2.3.1項測定，將獲得的圖譜帶入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》處理并計算，共標定10個主要成分為共有峰，生成的對照特征圖譜(R)如圖4所示。

2-橙皮苷圖4 止瀉靈糖漿對照特征圖譜

通過相似度計算，各批次間的相似度均大于0.9，結(jié)果如表3所示，色譜圖如圖5所示，說明該方法可用于止瀉靈糖漿的質(zhì)量控制。

表3 各批次樣品的相似度

圖5 各批次樣品的特征圖譜

2.3.4 共有峰歸屬分析 取處方各藥材適量，加甲醇制成含藥材量與成品含藥材量等同的供試品溶液，并按2.3.1測定，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，1號和3號色譜峰來源于陳皮和車前草，2號、4號、6號、8號和9號色譜峰來源于陳皮，5號色譜峰來源于雞矢藤和車前草，7號色譜峰來源于雞矢藤。

圖6 共有峰歸屬分析圖

3 討論

3.1 五倍子的薄層鑒別 本品處方君藥五倍子具有良好的抑菌作用[8]，所含鞣質(zhì)、沒食子酸也是其發(fā)揮止瀉作用的主要特征性成分，以沒食子酸為對照的薄層鑒別具有較好的專屬性，陰性對照無干擾?！吨袊幍洹?020年版“五倍子”中沒食子酸的檢視方法為254 nm熒光斑點，對比發(fā)現(xiàn)采用2%三氯化鐵顯色，顯色斑點更清晰。

3.2 陳皮的薄層鑒別 通過HPLC方法分析成品色譜圖各峰歸屬實驗發(fā)現(xiàn)，成品色譜圖中多個色譜峰能與陳皮藥材對應，故增加以陳皮對照藥材為對照的薄層鑒別項。比較了《中國藥典》2020年版“陳皮”和“保和顆粒”中橙皮苷的鑒別方法，結(jié)果以聚酰胺薄膜為層析介質(zhì)效果更佳。

3.3 橙皮苷的含量測定 止瀉靈糖漿中橙皮苷的測定方法參考《中國藥典》2020年版“陳皮”【含量測定】項，通過柱溫、流動相的pH值和流速等因素考察，表明方法具有良好的適用性及耐用性。

3.4 成品的特征圖譜的供試品處理方法 特征圖譜可以科學地評價藥物的真?zhèn)魏团伍g的質(zhì)量差異，止瀉靈糖漿為糖漿劑，其供試品溶液制備需除糖純化步驟，對比有機溶劑萃取法和大孔樹脂柱層析法，結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取法制備的供試品溶液色譜圖中色譜峰豐富，且基線和各峰分離度較好，能較全面地反映成品的質(zhì)量。