凌慶輝 陳 路
1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院藥劑科,廣西 南寧 530003;2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園,廣西 南寧 530023
狗蟻草為豆科鏈莢豆屬植物鏈莢豆Alysicarpusvagnalis(Linn.)DC的干燥根、葉及全草,性平、味甘、苦,具有活血通絡(luò)、駁骨消腫等功效,民間常用于治療慢性肝炎、跌打損傷等疾病[1-3]。文獻(xiàn)研究[4-5]發(fā)現(xiàn),目前國(guó)內(nèi)外僅有2篇文獻(xiàn)對(duì)狗蟻草中的化學(xué)成分(水楊酸、胡蘿卜苷、β-谷甾醇)進(jìn)行含量測(cè)定。研究[6]表明槲皮素能夠調(diào)控PI3K/AKT/NF- B信號(hào)通路,改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠的肝臟炎癥癥狀,對(duì)慢性肝炎具有治療作用,該作用與狗蟻草藥材主治慢性肝炎相一致。槲皮素的抗炎作用是其最核心最顯著的藥理作用之一[7]。本文以槲皮素為指標(biāo)性成分,探索其含量測(cè)定方法,為進(jìn)一步完善狗蟻草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。
1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);JN-52000DTS型超聲波清洗儀(寧波江南儀器廠);FA2204B型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)。
A.對(duì)照品溶液;B.供試品溶液;1.槲皮素圖1 狗蟻草HPLC色譜圖
1.2 材料 甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純,水為重蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制),其他試劑均為分析純。槲皮素對(duì)照品(批號(hào):100081-201408,中國(guó)食品藥品檢定研究院);狗蟻草3批樣品采自廣西南寧市郊,經(jīng)廣西藥用植物園藍(lán)鳴生教授鑒定為豆科植物狗蟻草Alysicarpusvagnalis(Linn. )DC。
2.1 溶液的制備
2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量,置于10 mL容量瓶中,加適量甲醇,超聲溶解,再加甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,制成每1 mL含槲皮素1.25 g的對(duì)照品溶液(1.25 g/mL)。
2.1.2 供試品溶液 取狗蟻草根粗粉約10 g,精密稱定,加10倍量70%乙醇回流提取2次,每次1 h,合并提取液,減壓回收乙醇至無(wú)醇味,殘?jiān)眠m量甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,即得供試品溶液。
2.2 含量測(cè)定
2.2.1 色譜條件 色譜柱:Prevail ODS-C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈(A)-1%乙酸(B);梯度洗脫:0~15 min,5%A;15~20 min,15%A;20~30 min,25%A;30~40 min,65%A;檢測(cè)波長(zhǎng):365 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃。在此條件下,分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜圖如圖1所示。
2.2.2 線性關(guān)系考察 依次精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL,置10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾。分別吸取上述對(duì)照品溶液10 μL,按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=364866X+109.58(R2=0.9996),如圖2所示,表明進(jìn)樣量在0.125~1.25 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線效果圖
2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10 μL,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD值為1.72%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液,分別于0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD值為0.94%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批南寧產(chǎn)狗蟻草藥材6份,按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素含量。結(jié)果槲皮素含量的RSD值為1.12%(n=6),表明重復(fù)性良好。
2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知槲皮素含量(1.0236 mg/g)的同一批南寧產(chǎn)狗蟻草藥材干品9份,每份約5 g,精密稱定,分別按100%的水平加入槲皮素對(duì)照品,按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定槲皮素的含量,計(jì)算回收率?;厥章?%)=[實(shí)測(cè)值(mg)-樣品含量(mg)]/對(duì)照品加入量(mg)×100%。結(jié)果平均回收率為99.3%,RSD值為1.06%(n=9),表明回收率良好。詳見(jiàn)表1。
表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表 (n=9)
2.2.7 樣品測(cè)定 取3批狗蟻草藥材,每批3份。每份取約10 g,粉碎成粗粉(過(guò)40目篩),按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算樣品中槲皮素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 不同批次狗蟻草槲皮素含量測(cè)定表 (n=3)
3.1 含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇 根據(jù)中藥及其制劑分析中含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇原則,含量測(cè)定指標(biāo)成分應(yīng)確保藥材及其制劑的有效性、安全性和專屬性,研究首選有效成分作為含量測(cè)定指標(biāo)成分[8]。以本研究[6]為例,槲皮素具有抗炎活性,是狗蟻草藥材發(fā)揮治療作用的有效成分,同時(shí)也是該藥材主治功能的重要體現(xiàn),故選擇槲皮素作為含量測(cè)定指標(biāo)成分。
3.2 流動(dòng)相的選擇 在參考文獻(xiàn)[9-11]的基礎(chǔ)上,對(duì)比分析了①甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)、②乙腈-0.4%磷酸溶液(30∶70)、③甲醇-0.4%磷酸溶液(47∶53)3種溶劑系統(tǒng),最終確定乙腈-1%乙酸為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫,槲皮素的分離度大于1.5,色譜圖峰形較理想。
狗蟻草是廣西壯族民間常用草藥,其乙醇提取物具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等多種藥理活性,具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[12-14]。目前,狗蟻草化學(xué)成分研究較為欠缺,分離鑒定的化合物不足20個(gè),且藥理作用研究對(duì)象均為提取物,具體是何種成分在起作用尚未明確,還有待進(jìn)一步研究。