雙波長HPLC法同時測定上清丸中梔子苷及連翹酯苷A含量

肖琳婧 秦學(xué)玲 付興情 金 蒙 龍 琴 張赟華

云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650106

上清丸來源于《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加減”[1]，但與現(xiàn)行處方一致的上清丸最先記載于《北京市中藥成方選集》[2]。上清丸現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十冊[3]，標(biāo)準(zhǔn)編號為 WS3-B-1878-95，標(biāo)準(zhǔn)收載大蜜丸和水丸兩種劑型，后增加水蜜丸的規(guī)格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荊芥、防風(fēng)、桔梗、連翹、梔子、黃芩(酒炒)、黃柏(酒炒)及大黃(酒炒)十二味藥材組成。主要有清熱散風(fēng)、解毒通便的功效。臨床上常用于頭暈耳鳴、目赤、鼻流黃涕、口舌生瘡、牙齦腫痛，大便秘結(jié)[4]。方中主藥大黃清熱涼血、瀉火通便，黃芩清上焦火，黃柏瀉下焦火，梔子瀉三焦火；輔以連翹、菊花、薄荷、荊芥、防風(fēng)疏散風(fēng)熱，清利頭目，川芎活血行氣止痛，白芷祛風(fēng)散寒，消腫止痛；佐以桔梗引藥上行，宜肺散風(fēng)，消腫利咽，以消上、中焦風(fēng)熱。文獻[5-7]報道，采用HPLC方法對上清丸中的歐前胡素、黃芩苷、綠原酸、大黃中蒽醌類等成分進行含量測定，但對上清丸梔子中梔子苷及連翹中連翹酯苷A 含量測定未見報道。

上清丸為2022年全國中成藥評價性抽驗重點監(jiān)管品種之一，本次專項抽驗，共抽取上清丸樣品103批次。抽樣地域覆蓋了全國26個省、自治區(qū)、直轄市，涉及14家生產(chǎn)企業(yè)，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3種劑型。為綜合評價市售上清丸中梔子和連翹質(zhì)量，本實驗采用了HPLC雙波長同時測定103批樣品中梔子苷及連翹酯苷A 含量，以期對上清丸中梔子及連翹的質(zhì)量進行評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；賽多利斯BS224S電子天平；賽多利斯SECURA225D電子天平。

A.混合對照品溶液；B.缺連翹陰性供試品溶液；C.供試品溶液

1.2 材料 方法學(xué)考察用的樣品：上清丸(水蜜丸，批號：A12003，廣州白云山陳李濟藥廠有限公司生產(chǎn))，其余103批次上清丸樣品來源于14家生產(chǎn)企業(yè)，由于國家專項抽驗，涉及數(shù)據(jù)保密，生產(chǎn)企業(yè)由A～N代替，具體信息見表3。梔子苷(批號：110749-201919，含量以97.1%計)、連翹酯苷A(批號：111810-201707，含量以97.2%計)，以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純(默克公司)，水為純化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用ZORBAX C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為238 nm(梔子苷)、330 nm(連翹酯苷A)。

表1 梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備 分別取梔子苷、連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的混合對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品重量差異項下大蜜丸，剪碎，取2 g，精密稱定；或取水蜜丸或水丸，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞三角錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，在實驗室模擬工藝，分別配制缺連翹、梔子的兩種細(xì)粉，分別取約1 g，同供試品溶液制備，即得兩種陰性供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗 按“2.2、2.3、2.4”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品，在上述試驗條件下，采用紫外檢測器檢測，測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明上述液相色譜條件下，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對照品保留時間相同的色譜峰，梔子苷、連翹酯苷A，分離度大于1.5，陰性供試品在相應(yīng)位置處未見色譜峰，表明其他藥味不干擾2種待測成分的測定，方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 ①精密稱取梔子苷、連翹酯苷對照品10.41 mg、10.29 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得對照品儲備液(C=400 μg/mL)；②精密吸取 5 mL、5 mL、5 mL、1 mL對照品儲備液置于 10 mL、20 mL、25 mL、10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻；③再取80 μg/ mL的對照品溶液5 mL置于20 mL量瓶、取20 μg/mL對照品溶液置于10 mL量瓶，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得系列線性溶液。取續(xù)濾液按“2.1”項下色譜條件分別進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，分別計算梔子苷的回歸方程為Y=15581X+5599.3(r=1.0000)、連翹酯苷A的回歸方程為Y=17230X-21735.4(r=0.9997)，說明梔子苷在 404.32～2.02 μg/mL、連翹酯苷A在 403.96～2.02μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取混合對照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測定，測得梔子苷、連翹酯苷A的峰面積RSD(n=6)分別為0.14%、0.10%，儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各進樣一次，測定各組分的峰面積，梔子苷、連翹酯苷A峰面積RSD(n=6)分別為0.45%、1.20%，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 取上清丸(批號：A12003)，按上述方法制備6份供試品溶液，進樣測定，測得梔子苷、連翹酯苷A 的含量RSD(n=6)分別為0.29%、0.45%，該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗 分別精密稱6份樣品(批號：A12003)0.5 g，采用加樣回收試驗方法，分別按下表精密加入2種對照品溶液，計算回收率和RSD。見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果

2.11 含量測定結(jié)果 取上清丸103批，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入HPLC中，采用外標(biāo)法計算各成分的含量，結(jié)果見表3。各生產(chǎn)企業(yè)梔子苷含量統(tǒng)計圖如圖2所示，連翹酯苷A如圖3所示。

圖2 不同生產(chǎn)企業(yè)上清丸梔子苷含量統(tǒng)計圖

表3 103批次上清丸樣品信息及梔子苷、連翹酯苷A含量測定結(jié)果

結(jié)果表明不同企業(yè)上清丸(大蜜丸)梔子苷的含量較集中且差異較小，但來自C、F、H生產(chǎn)的上清丸梔子苷不同批次間梔子苷含量差異較大。上清丸(水蜜丸)為A企業(yè)獨家生產(chǎn)，6批次梔子苷的含量差異較大，說明該企業(yè)不同批次樣品梔子藥材質(zhì)量存在差異。不同企業(yè)上清丸(水丸)梔子苷的含量差異大，L企業(yè)不同批次之間梔子苷的含量相差3倍。

結(jié)果表明不同企業(yè)上清丸連翹酯苷含量差異較大，參考《中國藥典》2020年版連翹項下規(guī)定，青翹和老翹中連翹酯苷A限度相差14倍[8]。其中A企業(yè)上清丸(大蜜丸)中的連翹酯苷A的含量相差15倍，水蜜丸中連翹酯苷A的含量相差10倍，主要是青翹和老翹投料不固定，造成連翹酯苷A含量差異較大。結(jié)合調(diào)研情況，僅有B和M企業(yè)固定青翹投料。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本研究比較了不同提取溶劑(90%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇)，不同提取方式(超聲30 min、加熱回流30 min)，不同回流時間(30 min、45 min、60 min)，最終確定最佳提取條件是70%乙醇加熱回流提取30 min。此條件提取較完全，通過上述色譜條件，可以較好地測定上清丸梔子苷及連翹酯苷A含量。

3.2 檢測波長的選擇 本研究通過二極管陣列檢測器檢測，梔子苷在238 nm波長附近均最大吸收并參照《中國藥典》2020年版一部梔子含量測定項下的規(guī)定[9]，選擇238 nm 為梔子苷檢測波長。連翹中連翹酯苷A在330 nm波長附近有最大吸收，并參照《中國藥典》2020年版一部連翹含量測定項下的規(guī)定[8]，選擇330 nm為連翹酯苷A檢測波長。

3.3 流動相的選擇 本實驗在篩選流動相時，通過對乙腈-水、甲醇-水的運行，篩選出乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，但色譜峰出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，進而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，同時測定上清丸中梔子苷及連翹酯苷A 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫時，供試品中梔子苷和連翹酯苷A可達(dá)到基線分離，峰型較好，并且干擾較少，出峰時間適中，故選取此條件為流動相。

3.4 樣品分析 通過測定103批上清丸梔子苷，部分企業(yè)上清丸不同批次間梔子苷含量的存在較大差異，說明各批次間均一性較差。為了提高上清丸的一致性，相關(guān)企業(yè)應(yīng)加強對投料梔子的質(zhì)量控制，對梔子產(chǎn)地、采收時間做出相應(yīng)的規(guī)定。

通過測定103批上清丸連翹酯苷A含量，部分企業(yè)上清丸中連翹酯苷A含量差異巨大，主要原因是上清丸中連翹投料不固定。為了保證上清丸質(zhì)量的均一性，各生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)固定青翹或老翹投料。

本實驗采用HPLC結(jié)合雙波長同時測定梔子苷及連翹酯苷A含量。所建立的方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，不同企業(yè)不同批次上清丸中梔子苷及連翹酯苷A的含量存在一定差異，可能與制劑生產(chǎn)所用原藥材的產(chǎn)地、來源、采收季節(jié)以及原藥材批間質(zhì)量差異等因素有關(guān)，提示相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注梔子及連翹原藥材質(zhì)量，并且在連翹投料過程固定青翹或老翹投料，不斷提高和完善上清丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保上清丸質(zhì)量穩(wěn)定和臨床療效一致。