丁香揮發(fā)油對(duì)小鼠皮膚影響的初步研究

蔡燕萍 趙思燁 顏偉泓 林欣欣 茍文韜 葉明星 吳藝錦 張偉云*

1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門市中藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361023；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)為桃金娘科蒲桃屬植物丁香的干燥花蕾，又稱為公丁香，具有藥用和食用價(jià)值，為我國(guó)重點(diǎn)開發(fā)藥材之一[1]。宋代《開寶本草輯副本》[2]、《證類本草》[3]和明代《本草品匯精要》[4]均記載丁香生交、廣南番，現(xiàn)《中華本草》[5]記載產(chǎn)于馬來(lái)西亞、東非沿岸國(guó)家及印度尼西亞，我國(guó)海南、廣東也有栽培。2020版《藥典》中丁香的性味歸經(jīng)記載為：辛，溫。歸脾、胃、肺、腎經(jīng)，有溫中降逆，補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，常用于食少吐瀉、呃逆嘔吐、心腹冷痛等病癥的治療[6]。丁香的干燥花蕾中含有豐富的揮發(fā)油，主要成分包括丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯[7]。研究表明丁香揮發(fā)油具有抗炎[8]、殺蟲[9]、抗氧化[6]、抑菌[10]、麻醉[11]和促進(jìn)透皮吸收[12]的藥理作用。

課題組曾對(duì)中藥護(hù)膚、驅(qū)蚊、抑菌洗衣液進(jìn)行過(guò)開發(fā)初探，因丁香揮發(fā)油具有良好的抑菌效果，所以筆者選用丁香揮發(fā)油為這款洗衣液的配方組成之一，但發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于丁香揮發(fā)油安全性的研究較少，本研究旨在考察丁香揮發(fā)油的皮膚刺激性，以評(píng)價(jià)該揮發(fā)油的安全性，為進(jìn)一步開發(fā)這款中藥護(hù)膚驅(qū)蚊洗衣液提供一定的參考。通過(guò)將本實(shí)驗(yàn)引入本科生綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，有助于鞏固學(xué)生對(duì)藥理學(xué)理論知識(shí)的理解，提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑脫毛膏(廣州菲諾化妝品有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)ICR小鼠共28只，雌雄各半，體重20～25 g，杭州醫(yī)學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002，合格證編號(hào)：20210506Abzz0100000542(雌)、20210506Abzz 0100000316(雄)。(自由飲食)實(shí)驗(yàn)條件：溫度20～26 ℃。

1.3 藥物與設(shè)備 中藥丁香購(gòu)自北京同仁堂廈門禾祥中醫(yī)門診部，產(chǎn)地廣西。實(shí)驗(yàn)所用丁香由廈門大學(xué)藥學(xué)院陳全成副教授和張偉云老師鑒定為桃金娘科蒲桃屬植物丁香的干燥花蕾(EugeniacaryophyllataThunb.)。ZNHW電熱套，邦西儀器科技上海有限公司生產(chǎn)；CP512電子天平，奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 丁香揮發(fā)油的提取 取廣西丁香藥材 1 kg，分為10份，每份分別置于 2000 mL 圓底燒瓶中，1份藥材加入8倍量的蒸餾水[13]，浸泡 24 h，采用水蒸氣蒸餾法加熱提取丁香揮發(fā)油 4 h (沸騰前設(shè)置 200 ℃，沸騰后可降溫為180 ℃)，收集丁香揮發(fā)油，轉(zhuǎn)至冰箱4 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)(一次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)) 取SPF級(jí)ICR小鼠12只，雌雄各半，所有小鼠單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為2組，每組6只。一組為正常對(duì)照組，一組為實(shí)驗(yàn)組。隨機(jī)分組后，對(duì)全部小鼠背部脊柱兩側(cè)脫毛，兩側(cè)脫毛范圍各為 2 cm×3 cm，24 h 后進(jìn)行皮膚劃傷，左側(cè)皮膚不劃傷，右側(cè)皮膚劃傷為“=”字形，使皮膚表面稍稍出血即可，劃傷示意圖如圖1所示，劃傷后立即涂藥，空白對(duì)照組涂純水，實(shí)驗(yàn)組涂丁香揮發(fā)油，給藥后均用紗布覆蓋，膠布固定，敷用24 h，24 h后用蒸餾水清洗涂抹部位皮膚，在清洗完涂抹部位皮膚后的1 h、24 h、48 h和72 h時(shí)觀察小鼠左右兩側(cè)涂抹部位的皮膚反應(yīng)，觀察小鼠涂抹部位皮膚是否出現(xiàn)紅斑、水腫等現(xiàn)象，按表1進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分[14]，以小鼠積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)24 h、48 h、72 h各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強(qiáng)度[14]。

圖1 小鼠脫毛劃傷示意圖

表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分表

表2 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)表

2.3 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 小鼠的試驗(yàn)方法與急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)相同，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹7 d，去除受試物再觀察7 d。每日觀察時(shí)，需用蒸餾水清洗涂抹部位皮膚，在清洗完涂抹部位皮膚的1 h后再進(jìn)行觀察，按表2進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分。結(jié)果評(píng)價(jià)：按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分，以表2判定皮膚刺激強(qiáng)度[14]。

每天每只動(dòng)物平均積分=∑紅斑和水腫積分/受試動(dòng)物數(shù)× 14

3 結(jié)果與分析

3.1 急性皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)(一次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)) 一次給藥后，經(jīng)觀察，發(fā)現(xiàn)所有小鼠除了表現(xiàn)較為躁動(dòng)外，未見全身中毒的現(xiàn)象，無(wú)死亡，各組小鼠的行為、活動(dòng)、排泄、飲食以及外觀體征均無(wú)異常。正常對(duì)照組小鼠和實(shí)驗(yàn)組小鼠的左側(cè)完整皮膚和右側(cè)破損皮膚在清洗完揮發(fā)油的1 h、24 h、48 h、72 h的時(shí)刻均未發(fā)現(xiàn)紅斑、水腫等現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與給藥正常皮膚組皮膚反應(yīng)積分比較，正常破損皮膚組與給藥破損皮膚組皮膚反應(yīng)積分比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)皮膚反應(yīng)積分均值和皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)見表3，急性皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)中小鼠代表性皮膚反應(yīng)的照片如圖2所示。該結(jié)果提示丁香揮發(fā)油對(duì)小鼠正常皮膚和破損皮膚均無(wú)刺激性。

a.無(wú)紅斑、水腫的照片 b.無(wú)紅斑、水腫的照片圖2 急性皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)中小鼠皮膚反應(yīng)代表性圖

表3 急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚反應(yīng)積分值 (n=6)

3.2 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 多次給藥后，每日觀察發(fā)現(xiàn)所有小鼠除了表現(xiàn)較為躁動(dòng)外，未見全身中毒的反應(yīng)，無(wú)死亡，各組小鼠的行為、活動(dòng)、排泄、飲食以及外觀體征均無(wú)異常。正常對(duì)照組小鼠左右兩側(cè)皮膚均正常，無(wú)出現(xiàn)紅斑、水腫等情況。實(shí)驗(yàn)組的小鼠前8 d中，每日有2～3只小鼠右側(cè)破損皮膚出現(xiàn)了不同程度的紅斑、水腫，而14 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組小鼠的左側(cè)正常皮膚未出現(xiàn)紅斑、水腫的情況。停止涂抹揮發(fā)油后的第二天開始，小鼠右側(cè)破損皮膚涂抹揮發(fā)油部位的紅斑與水腫消退，兩側(cè)皮膚漸漸均呈現(xiàn)正常狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，空白正常皮膚組與給藥正常皮膚組皮膚反應(yīng)積分比較，空白破損皮膚組與給藥破損皮膚組皮膚反應(yīng)積分比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，各組每日皮膚反應(yīng)積分值見表4，皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)見表5，多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)中小鼠代表性皮膚反應(yīng)的圖片如圖3所示。

a.有輕微紅斑的照片 b.有明顯紅斑的照片 c.有輕微紅斑、輕微水腫的照片圖3 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)中小鼠皮膚反應(yīng)代表性圖

表4 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚反應(yīng)積分值表

表5 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià) (n=6)

4 討論與結(jié)論

皮膚刺激實(shí)驗(yàn)指的是使用產(chǎn)品前要評(píng)估其引起皮膚刺激的相關(guān)測(cè)試，它包括急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)和多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)兩種方法。單次皮膚刺激試驗(yàn)考察被檢物對(duì)皮膚的直接刺激性和程度[14]，多次皮膚刺激試驗(yàn)不僅能反映被檢物對(duì)皮膚的直接刺激，而且還能反映被檢物對(duì)皮膚中遠(yuǎn)期的慢性累積性刺激[16]。

在急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)24 h連續(xù)經(jīng)完整皮膚和破損皮膚給藥，小鼠正常皮膚和破損皮膚的皮膚反應(yīng)平均積分值為0，小于0.5，未見中毒的反應(yīng)，這提示使用者在單次使用或偶爾使用時(shí)具有一定的安全性，但急性皮膚刺激試驗(yàn)只對(duì)較強(qiáng)的刺激原敏感，不能完全說(shuō)明丁香揮發(fā)油外用的安全性，所以課題組開展了多次給藥皮膚刺激，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)強(qiáng)刺激原敏感，對(duì)弱刺激原也敏感，可考察每日使用或連續(xù)數(shù)日使用丁香揮發(fā)油對(duì)皮膚刺激的有無(wú)及大小，經(jīng)過(guò)7天的給藥，實(shí)驗(yàn)組中個(gè)別小鼠的涂抹揮發(fā)油的破損皮膚部位出現(xiàn)輕微紅斑、明顯紅斑、輕微水腫、輕度水腫等現(xiàn)象，經(jīng)計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組小鼠正常皮膚和破損皮膚的每天每只動(dòng)物皮膚積分值分別為0和0.31，均小于0.5，以表2評(píng)定皮膚刺激強(qiáng)度，丁香揮發(fā)油對(duì)小鼠正常皮膚和破損皮膚均無(wú)刺激性，而針對(duì)破損皮膚出現(xiàn)局部皮膚反應(yīng)的現(xiàn)象，可解釋為外用藥對(duì)破損皮膚稍具刺激性的普遍表現(xiàn)，使用時(shí)保證給藥皮膚的完整性即可避免[16]。

丁香揮發(fā)油作為丁香的主要藥效部位，化學(xué)成分豐富，藥理作用廣泛，具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。研究結(jié)果表明，丁香揮發(fā)油對(duì)小鼠的正常皮膚和破損皮膚刺激性小，具有一定的安全性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為前期課題組中藥護(hù)膚驅(qū)蚊抑菌洗衣液進(jìn)一步的開發(fā)提供了理論參考，也可后期丁香其他的產(chǎn)品的應(yīng)用和開發(fā)提供新的思路，展示了丁香一定的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值，但是該實(shí)驗(yàn)僅在一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且數(shù)據(jù)出現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)差大于均數(shù)的情況，表明數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布的現(xiàn)象，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異性大所導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有局限性，仍需在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)互相驗(yàn)證，并擴(kuò)大或采用人重組皮膚模型進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，以獲取更加可靠的結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及中藥化學(xué)的提取制備方法與技術(shù)、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作與技能，有利于激發(fā)學(xué)生科研興趣，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維。