金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

吳文慧　田雨純　牛吉祥　楊翼航　何瑞

摘? ? 要：為探究金銀花與牡丹皮對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum）的抑菌效果，采用菌絲生長速率法測定金銀花與牡丹皮的乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的抑菌作用。結(jié)果顯示：單一金銀花的乙醇提取物和金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物均對黃瓜枯萎病菌有一定的抑菌作用，且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果越顯著。單一金銀花的乙醇提取物濃度為25.0 mg·mL，作用72 h后對病原菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率為35.94%；金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物濃度為25.0 mg·mL，作用72 h，復(fù)配比例為9∶1、7∶3時抑菌率均可以達(dá)到100%。綜上可知，單一金銀花的乙醇提取物及金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌均有抑制作用，但二者復(fù)配抑菌效果較好。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮孢菌黃瓜?；?；黃瓜枯萎病；金銀花；牡丹皮；乙醇提取復(fù)配物；抑制作用

中圖分類號：S482.2+92? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.09.009

Inhibitory Effect of the Ethanol Extract of Honeysuckle and Peony Bark on Fusarium Wilt of Cucumber

WU Wenhui， TIAN Yuchun， NIU Jixiang， YANG Yihang， HE Rui

（College of Food and Environment， Jinzhong University of Information Technology， Jinzhong， Shanxi 030805， China）

Abstract： In order to explore the antibacterial effect of honeysuckle and peony bark on Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum， the mycelium growth rate method was used to determine the antibacterial effect of the ethanol extract of honeysuckle and peony bark on F. oxysporum f.sp.Cucumerinum. The results showed that the ethanol extract of single honeysuckle and the ethanol extract complex of honeysuckle and peony bark had certain antibacterial effect on F. oxysporum f.sp.Cucumerinum， and the antibacterial effect was more significant with the increase of concentration. The ethanol extract of single honeysuckle had the strongest antibacterial activity against pathogenic bacteria after 72 h at a concentration of 25.0 mg·mL^-1， and the bacteriostatic rate was 35.94%. The ethanol extract of honeysuckle and peony bark was compounded at a concentration of 25.0 mg·mL， 72 h of action， and the compounding ratio was 9∶1 and 7∶3. The bacteriostatic rate could reach 100%. In conclusion， the ethanol extract of single honeysuckle and the ethanol extract complex of honeysuckle and peony bark have inhibitory effects on cucumber Fusarium wilt， but the combination of the two has better bacteriostatic effect.

Key words： Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum; cucumber Fusarium wilt; honeysuckle; peony bark; ethanol extract complex; inhibition

黃瓜（Cucumis sativus L.）為葫蘆科黃瓜屬，一年生攀援或蔓生草本，以種子繁殖、直播或育苗移栽等方式進(jìn)行繁殖。黃瓜在生長過程中會受到枯萎病的侵襲，該病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的一種土壤傳染病[1]。它從植物的根部侵入，是寄生在維管束內(nèi)的系統(tǒng)性病害，其致病機(jī)理主要包括導(dǎo)管堵塞假說、毒素作用假說、信號傳導(dǎo)系統(tǒng)、克服植物防御系統(tǒng)等。該病不僅嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量，且其病原菌的毒素可嚴(yán)重危害動物及人類的健康[2-3]。

目前施加農(nóng)藥是控制枯萎病的主要方式，但農(nóng)藥的使用不僅會造成嚴(yán)重的“3R”問題，還可能危及人類的身體健康。近些年，生物防治以環(huán)境友好、安全高效、可持續(xù)性強(qiáng)的特征成為可替代化學(xué)防治的重要方式。金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥蓓蕾，其成分包括綠原酸、異綠原酸、黃酮化合物、芳樟醇、雙花醇等[4]。有數(shù)據(jù)證實，金銀花對部分植物特有的疾?。ㄈ缣烤也【⒒颐共【?、枯萎病菌、早疫病菌）都有相應(yīng)的抑制作用。牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，主要包含酚及苷類、單萜及其苷類、三萜類、甾醇類、有機(jī)酸、黃酮類等成分，此外還含有大量的多糖及揮發(fā)油[5]，具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、控制新陳代謝、止痛等[6]。張新強(qiáng)等[7]發(fā)現(xiàn)，金銀花對辣椒炭疽病原菌和番茄灰霉病原菌均有顯著的抑菌作用。朱立成等[8]發(fā)現(xiàn)，牡丹皮丙酮提取物對番茄灰霉病菌、楊樹潰瘍病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌5種病原菌均有明顯的抑制作用。以上研究表明，這2種中草藥對多種植物病原真菌都有一定的抑制作用，因此可將其作為生物防治的植物材料。

本研究以應(yīng)用中草藥進(jìn)行生物防治為切入點，開展金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌的抑菌試驗，探究其最佳抑菌濃度及抑菌效果，為金銀花與牡丹皮作為植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)，也為黃瓜枯萎病防治與新型植源性殺菌劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用金銀花和牡丹皮均購自商洛千草行農(nóng)副產(chǎn)品有限公司。黃瓜枯萎病菌（尖孢鐮孢菌黃瓜專化型）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實驗室提供。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑及耗材 95%乙醇、葡萄糖、瓊脂粉、馬鈴薯、濾紙、紗布。

1.2.2 儀器設(shè)備 BSA224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、RO.DI實驗室超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）、SW-CJ-2F潔凈工作臺（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、100～1 000 μL移液槍（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、BGZ-146電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、CX31-32C02光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯）、BGZ-250光照培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 中草藥乙醇提取物的制備 將14 g金銀花粉末與60%的乙醇溶液，14 g牡丹皮粉末與75%的乙醇溶液均按1∶15比例分別裝入索氏提取器內(nèi)，提取2 h，得到初步提取物質(zhì)。將初提物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度60 ℃）內(nèi)進(jìn)行濃縮，并進(jìn)一步于蒸發(fā)皿中用酒精燈加熱，待出現(xiàn)黏稠膏狀物后熄滅酒精燈，得到所需乙醇提取物。

1.3.2 菌種活化 將分離的尖孢鐮孢菌黃瓜?；途辏臃N置PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28 ℃，無光照。

1.3.3 藥物配制 取金銀花乙醇提取物，加水配制100 mg·mL、150 mg·mL、200 mg·mL、250 mg·mL的藥液，裝入試管保存。將金銀花與牡丹皮乙醇提取物按照質(zhì)量比9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9配制不同比例的乙醇提取復(fù)配物，然后分別加水配制100 mg·mL、150 mg·mL、200 mg·mL、250 mg·mL的金銀花與牡丹皮乙醇提取復(fù)配物藥液，裝入試管保存。

1.3.4 加藥培養(yǎng)基制備 用移液槍分別吸取1 mL不同濃度的藥液，轉(zhuǎn)移至滅菌的培養(yǎng)皿中，再向培養(yǎng)皿中加入9 mL融化的PDA培養(yǎng)基，得到濃度為10 mg·mL、15 mg·mL、20 mg·mL、25 mg·mL的加藥PDA培養(yǎng)基，每組設(shè)置3次重復(fù)；對照組為1 mL無菌水加9 mL融化的PDA培養(yǎng)基。

1.3.5 黃瓜枯萎病菌菌絲生長測定 使用打孔器提取直徑為5 mm且菌落生長良好的菌餅，放置在加藥PDA培養(yǎng)基平板中央，以無菌水培養(yǎng)基作為對照，3個生物學(xué)重復(fù)。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育48、72 h時，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量培養(yǎng)基中的菌落直徑，按照菌落生長抑制率公式計算各處理組的生長抑制率。

生長抑制率=對照菌落直徑－處理菌落直徑/對照菌落直徑×100%

1.3.6 黃瓜枯萎病菌菌絲形態(tài)觀察 將牡丹皮與金銀花復(fù)配比為1∶9、濃度為25.0 mg·mL的復(fù)配物處理組和對照組培養(yǎng)4 d后的菌絲分別做成切片，在光學(xué)顯微鏡40倍鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一金銀花及復(fù)配物對病原菌菌落生長的影響

由表1、圖1可知，供試樣品在處理48 h后，單一金銀花和各種比例乙醇提取復(fù)配物對病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，并隨著藥物濃度的增加，菌落直徑逐漸減小，抑菌效果逐漸增加。單一金銀花的乙醇提取物在濃度為10.0 mg·mL時，病原菌菌落直徑為2.68 cm，抑菌效果最差；在濃度為25.0 mg·mL時，病原菌菌落直徑為2.52 cm，抑菌效果最好。金銀花與牡丹皮的乙醇提取復(fù)配物在復(fù)配比為1∶9時，菌落的直徑在同濃度組中均為最大，整體的抑菌效果最差；在復(fù)配比為9∶1時，菌落的直徑在同濃度組中均為最小，整體的抑菌效果最好，其他比例次之。復(fù)配比為9∶1時，濃度為15.0～25.0 mg·mL的抑菌效果最好，菌落直徑均為0.50 cm。

由表1、圖2可知，當(dāng)供試樣品在處理72 h后，金銀花乙醇提取物和各種比例乙醇提取復(fù)配物表現(xiàn)出的抑菌效果與48 h處理后的抑菌效果基本一致。復(fù)配比為9∶1時，15.0～25.0 mg·mL濃度組的菌落直徑仍保持0.50 cm，其余處理組的病原菌菌落直徑均有不同程度的增加。這表明金銀花與牡丹皮乙醇提取物的復(fù)配比為9∶1時對黃瓜枯萎病病原菌抑制效果最好。

2.2 單一金銀花及復(fù)配物對病原菌的抑菌率

由表2可知，樣品處理48 h后，單一金銀花和復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌的抑菌率最低為26.46%，最高可達(dá)到100%。單一金銀花乙醇提取物在濃度為25.0? mg·mL時，抑菌率最高，為31.87%。金銀花和牡丹皮乙醇提取物復(fù)配時，抑菌率大于單一金銀花的抑菌率；在濃度為10.0 mg·mL時，各種配比復(fù)配物的抑菌率均為最小，隨著濃度的增加抑菌率呈現(xiàn)增加的趨勢，在濃度為25.0 mg·mL時，各種配比各種比例的抑菌率均達(dá)到最大值。其中，復(fù)配比9∶1時，濃度為15.0～25.0 mg·mL的抑菌率均為100%；復(fù)配比7∶3時，濃度為25.0 mg·mL的抑菌率也達(dá)到100%。從整體分析可以看出，不同配比處理對病原菌的抑菌率依次為：9∶1>7∶3>5∶5>3∶7>1∶9。

分析上述結(jié)果可知，不同濃度的單一金銀花和乙醇提取復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌均有抑制作用。當(dāng)處于同一時間，同一濃度下，不同復(fù)配比的乙醇提取物抑制作用比單一金銀花的乙醇提取物抑制作用更有效果，且不同復(fù)配比之間抑制作用差異也較為明顯。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇提取物濃度的增加，抑制程度越高，抑菌效果越好，抑菌率也隨之提高，且在特定的比例及濃度下抑菌效果可達(dá)到100%。

2.3 復(fù)配物對病原菌菌絲形態(tài)的影響

牡丹皮與金銀花乙醇提取物復(fù)配比為1∶9，濃度為25.0 mg·mL的處理組和對照組在培養(yǎng)4 d之后，用顯微鏡40倍鏡觀察菌絲形態(tài)（圖3），可見處理組中的菌絲生長異常，出現(xiàn)膨脹畸變，斷裂等現(xiàn)象（圖3-G）；對照組的菌絲生長正常，菌絲體細(xì)長且分枝較多，整體呈現(xiàn)光滑狀態(tài)（圖3-H）。觀察結(jié)果說明，處理組藥物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用較為明顯。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，單一金銀花及乙醇提取復(fù)配物對黃瓜枯萎病菌的菌絲均有不同程度的抑制作用，主要體現(xiàn)為造成不利環(huán)境抑制菌絲生長。其中，單一金銀花乙醇提取物在濃度為25.0 mg·mL時，抑菌效果最好；金銀花與牡丹皮乙醇提取物復(fù)配比9∶1時，濃度為15.0～25.0 mg·mL時抑菌效果最好，抑菌率可達(dá)到100%。復(fù)配物處理后的菌絲體在顯微鏡下觀察，可以明顯地看到病原菌菌絲出現(xiàn)膨脹斷裂等畸變。

3.1 金銀花對病原菌的抑制作用

本研究發(fā)現(xiàn)金銀花的乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，但不同濃度的提取物抑菌效果不同。孫全友等[9]認(rèn)為，金銀花抗菌可能是改善了有益菌而對致病菌起作用，也可能與破壞細(xì)菌細(xì)胞壁完整性有關(guān)。王乾芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花枝葉發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)出抑菌效果，且比未發(fā)酵提取液的抗氧化能力更強(qiáng)。

3.2 牡丹皮對病原菌的抑制作用

有研究報道牡丹皮乙醇提取物對病原菌同樣有抑制作用。胡永志等[11]發(fā)現(xiàn)牡丹皮提取物對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌具有一定的抑菌活性。魏慧等[12]研究牡丹皮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果顯示抑菌率達(dá)到了82.1%。

3.3 金銀花與牡丹皮復(fù)配物對病原菌的抑制作用

研究表明，單一金銀花乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的生長有一定的抑制作用，且與牡丹皮乙醇提取物復(fù)配時，不僅表現(xiàn)出優(yōu)于單劑的抑菌效果，還可以將黃瓜枯萎病菌完全殺死，極大地促進(jìn)了復(fù)配殺菌劑的快速發(fā)展[13-14]。黃南[15]通過微生物有機(jī)肥對黃瓜枯萎病的影響，表明生防菌解淀粉芽孢桿菌SQR9和有機(jī)肥經(jīng)過二次發(fā)酵形成的微生物有機(jī)肥（BIO），能有效抑制土壤中尖孢鐮孢菌黃瓜專化型的數(shù)量。Abdelkhalek等[16]研究證實，Bacillus velezensis PEA1有較強(qiáng)抗尖孢鐮刀菌的功效。Ahlem Nefzi等[17]通過高效的醇提取法獲得苦參提取物，并驗證得出其對鐮孢菌具有抑制作用。

近些年，許多人為了達(dá)到除蟲殺菌的目的而濫用各種化學(xué)殺菌劑，使植物病原菌的抗藥性增強(qiáng)，并且造成了環(huán)境污染，綠色環(huán)保、安全高效的植物源殺菌劑的開發(fā)逐漸成為植物保護(hù)領(lǐng)域研究的重點。金銀花與牡丹皮是我國傳統(tǒng)中藥材，含有種類較為豐富的次生代謝物質(zhì)，如酚類、黃酮類、萜類、皂苷、有機(jī)酸等[18-20]，具有較好的農(nóng)藥活性，其中酚類在植物對病原菌的非宿主抗性中發(fā)揮重要作用。由藥用植物制成的植物源殺菌劑相對于化學(xué)殺菌劑更加綠色環(huán)保，利用藥用植物開發(fā)天然的綠色殺菌劑也是現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向[21]。

目前，中草藥提取物用于植物病菌抑制研究報道還較少，應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)這方面的研究。本研究中發(fā)現(xiàn)的2種中草藥乙醇提取物的作用方式、作用機(jī)理以及在活體上的抑菌效果還有待于進(jìn)一步研究。

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