天津地區(qū)梨輪紋病病原菌的分離與鑒定

汪宇軒　周濤　周逸文　李齊升　王卉　單宏英

摘? ? 要：梨是我國僅次于蘋果的重要水果，隨著種植面積的增大，在生產(chǎn)過程中梨樹易遭受多種病害的威脅，其中輪紋病是嚴重威脅梨產(chǎn)業(yè)的病害之一，常造成重大經(jīng)濟損失。梨是天津薊州區(qū)特色水果之一，輪紋病主要危害成熟期果實，化學防治效果不明顯，且該病害病原菌種類呈多樣化。為了明確致病菌種類，采用組織分離法、形態(tài)學比較分析、致病性檢測和分子生物學手段對病原菌進行鑒定。結(jié)果表明：于病樣組織中分離得到一株真菌ZT98，在PDA培養(yǎng)基上呈灰色圓形菌落，菌絲有隔膜，尖端較細，致病性分析結(jié)果顯示，菌株ZT98接種2～3 d即出現(xiàn)同心淺褐色輪紋，發(fā)病后期果實呈黑褐色皺縮，表層布滿一層深灰色菌絲和黑點，與田間癥狀基本一致；提取ZT98基因組DNA后進行 ITS基因擴增并測序，在NCBI獲得基因序列登錄號為OR054159，ITS基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，ZT98與葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）聚于同一分支，同源性為100%。綜上，本研究分離得到了一株天津地區(qū)梨輪紋病致病菌ZT98，結(jié)合形態(tài)學特征和ITS序列比對分析，明確了ZT98的分類地位，為該病害的精確診斷和有效防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梨；輪紋?。黄咸炎痪?；ITS

中圖分類號：S432.1? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.09.008

Isolation and Identification of A Pathogen Causing Pear Ring Spot in Tianjin

WANG Yuxuan ZHOU Tao ZHOU Yiwen LI Qisheng WANG Hui SHAN Hongying

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： Pear， second only to apples， is an important fruit in China. Various diseases are prone to attack pear during cultivation and production with the increased planting area. Ring rot， causing significant economic losses frequently， is one of the serious diseases that endangers the pear industry. The pathogens of pear ring rot are a little diverse according to the previous studies. Therefore， this study tried to isolate and identify the pathogens of ring rot by tissue direct isolation， morphological analysis， pathogenicity detection and molecular determination. The results indicated that a strain ZT98 was obtained after isolation and purification of snow pear ring spot infected samples， which showed gray round colonies on PDA medium. Mycelia of ZT98 had diaphragm with a thinner top. Pathogenicity detection according to Koch's rules displayed that ZT98 was a pathogen caused serious symptoms on pear fruits. The concentric brown rings were consistent with the symptoms in the field. The infected sites became dark brown at the later infecting stage but without spores were observed. Phylogenetic analysis of ZT98 was performed by extracting the genomic DNA and amplifying ITS. The ITS Genebank accession number of ZT98 was OR054159. ZT98 was clustered in the same branch as Botryosphaeria dothidea with 100% homology. In conclusion， this study determined the pathogen causing pear ring rot in Tianjin， providing a basis for accurate diagnosis and effective control of this disease.

Key words： pear；pear ring rot；Botryosphaeria dothidea；ITS

梨是薔薇科梨屬的一種喬木植物，有“天然礦泉水”之稱。梨在我國的種植歷史十分悠久，最早可追溯到春秋戰(zhàn)國時期。我國是梨種植大國，梨的種植面積僅次于蘋果，在我國占有重要的經(jīng)濟地位[1-3]，種植地區(qū)主要分布在16個省、直轄市，包括華北、華中、東北、西北、魯東等地區(qū)，華南和西南地區(qū)種植面積相對較少。在種植生產(chǎn)過程中，梨常遭受多種病害的威脅，如梨銹病、黑星病、輪紋病和黑斑病等[4]。梨輪紋病又叫粗皮病或瘤皮病，是我國北方梨主產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，該病害受濕度影響較大，在多雨年份危害嚴重。梨輪紋病主要由葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）病原菌引起，在梨的樹干、果實和葉片均造成嚴重同心輪紋癥狀，嚴重時導致葉片脫落、果實腐爛或樹勢衰弱，造成大面積爛果和果園絕產(chǎn)[1]。

梨輪紋病最早在日本被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在我國東北和西南地區(qū)報道[1， 3]。近年來梨輪紋病病害在亞洲擴展速度快，已遍布韓國等鄰國梨產(chǎn)業(yè)園區(qū)[5]?；瘜W防治梨輪紋病病害常造成嚴重的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，選育抗病品種已經(jīng)成為優(yōu)先選擇，但針對梨輪紋病抗病品種和有效藥劑的篩選報道較少，種質(zhì)資源的收集和鑒定也需要大量的人力物力和時間。張璐等[6]發(fā)現(xiàn)，碭山酥梨和雪花梨抗輪紋病菌的能力顯著優(yōu)于豐水梨和南果梨，且通過藥劑篩選發(fā)現(xiàn)咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對梨輪紋病菌具有明顯的抑制效果。

梨是天津的特色水果之一，種植面積達6萬hm，其中靜海區(qū)（約2萬hm）、薊州區(qū)（約3萬hm）、北辰區(qū)、武清區(qū)和西青區(qū)共計種植約1萬hm，主打優(yōu)質(zhì)精品梨的發(fā)展趨勢進入市場。薊州區(qū)具有悠久的梨樹種植歷史，種植區(qū)域覆蓋11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)100多個旅游村和景區(qū)。部分梨園近年發(fā)現(xiàn)較嚴重的輪紋病病害，平均發(fā)病率達30%～50%，大部分果園發(fā)病率在30%[7]。發(fā)病果實品質(zhì)和產(chǎn)量均下降，影響樹勢和果園的長期發(fā)展，且化學藥劑對該病害的防治效果不顯著，給果農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。梨輪紋病的致病菌種類在不同梨產(chǎn)區(qū)呈多樣化[8-9]，同一病原菌在不同地區(qū)導致的癥狀有顯著差別[10]。因此，確定輪紋病的致病菌對于該病害的防治至關(guān)重要。本研究通過對天津薊州區(qū)下營鎮(zhèn)梨園輪紋病致病菌的分離純化、形態(tài)學比較、致病性檢測和分子生物學鑒定等手段，明確了梨輪紋病致病菌種類和分類地位，為該病害的田間診斷和有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害樣品采集

梨果實輪紋病樣品采集自天津市薊州區(qū)下營鎮(zhèn)梨園（N40°18′ ，E117°45′），采樣梨園輪紋病發(fā)病程度約30%。

1.2 病原菌分離純化和形態(tài)觀察

選取有典型輪紋病病害癥狀的雪梨果實，將其病健交界處組織切成若干個0.5 cm×0.5 cm小塊后，經(jīng)75 % 酒精消毒45 s，無菌水潤洗3次后，待組織風干水分時，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，培養(yǎng)皿封口后于28 ℃ 培養(yǎng)3～5 d。PDA培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水定容至1 000 mL。將生長單一無污染菌落采用菌餅打孔法進行純化，培養(yǎng)過程中觀察記錄分離菌株的生長特征，包括病原菌的菌絲、孢子、孢子梗和孢子囊等典型形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 病原菌的致病性檢測

依據(jù)柯赫氏法則（Koch's Rule）對分離菌株進行致病性檢測。雪梨果實經(jīng)1% 次氯酸鈉和75% 酒精各消毒30 s，再置于無菌水中潤洗3次，待表皮風干水分后，用無菌針于接種點刺傷雪梨果實表皮制造輕微傷口從而利于病原菌侵染。于PDA培養(yǎng)基上生長5 d的分離菌株菌餅置于大小一致的雪梨果實接種點上，每個果實接種一塊菌餅，無菌培養(yǎng)基接種雪梨果實為陰性對照。接種后將梨果實置于無菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，利用無菌膜封口利于保濕和防止雜菌污染，于28 ℃ 培養(yǎng)并觀察和記錄發(fā)病情況。在發(fā)病梨果實組織的病健交界處再次采用1.2中描述的方法分離純化病原菌，通過形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，確保與接種菌株是同一種菌[11]。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

將分離菌株于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，用無菌牙簽挑取收集菌絲于1.5 mL無菌管中，采用Biowott真菌DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，檢測濃度后利用瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA質(zhì)量。通過形態(tài)學觀察該致病菌屬應(yīng)是葡萄座腔菌屬的真菌，利用真菌rDNA-ITS通用引物（ITS1F：CCGTAGGTGAACCTG；ITS4R：TCCTCCGCTTATTGATATGC），采用Takara的PrimeSTAR Max Premix試劑盒（R045A）對ITS基因進行PCR擴增，反應(yīng)總體系50 μL：PrimeSTAR Max Premix 25 μL、ITS1F和ITS4R引物各2.0 μL、DNA模板溶液2.0 μL、ddH2O 19.0 μL。反應(yīng)程序為98 ℃ 預變性1 min，98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min；共35個循環(huán)；最后一個循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 條件下終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托華大基因有限公司進行序列測定。將ITS基因序列在NCBI中BLAST比對同源性，篩選同源性高的序列并利用MEGA 11.0中鄰接法（neighnour joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確致病菌株的種類和分離地位[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪梨輪紋病危害癥狀

梨輪紋病病原菌可危害果樹樹干、枝條、葉片和果實，其中對于成熟期的果實危害較為嚴重，影響果實成熟和質(zhì)量，給果農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病原菌危害初期形成淺褐色水漬斑點，逐漸擴大形成同心的淺褐色環(huán)形輪紋，環(huán)形輪紋間是健康雪梨組織顏色。果實發(fā)病處的表皮脆軟，若果園濕度大，擠壓易流出較為粘稠的褐色液體，并有酸臭味道。隨著時間延長，發(fā)病點顏色由淺褐色逐漸變成深褐色，病果持續(xù)發(fā)病10 d左右即全部腐爛，病斑呈黑褐色皺縮，因失水而變成僵果，表層布滿一層深灰色菌絲并且布滿黑點（圖1-A和圖1-B）。挑取雪梨果實病斑處的菌絲和子實體進行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)無隔菌絲，未見孢子（圖1-C）。

2.2 雪梨輪紋病病原菌的分離純化

雪梨輪紋病的病健交界處經(jīng)病原物分離后得到形態(tài)一致的菌落2個，進一步純化和形態(tài)學觀察確認是同一種菌。菌株ZT98在PDA培養(yǎng)基上生長初期呈蓬松灰白色絨毛狀，菌落邊緣光滑且透明，菌絲無色，具有隔膜和較細的分枝，菌絲寬度約2.3～5.6 μm 生長至5～7 d即長滿直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，且無色素沉積（圖2），繼續(xù)培養(yǎng)至14 d菌落呈灰白色，且菌板背面中心處變?yōu)楹谏?，但未觀察到孢子或產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

2.3 菌株ZT98的致病性檢測

將分離得到的菌株ZT98依據(jù)柯赫氏法則進行致病性驗證，通過菌餅打孔法直接回接到健康且大小均一的雪梨果實上，同時接種PDA培養(yǎng)基空白菌餅作陰性對照，接種的第1天、第3天、第5天和第7天對照均無癥狀（圖3-A、圖3-B、圖3-C、圖3-D）。接種菌株ZT98的雪梨果實3 d后在接種點形成褐色水漬狀斑圈，接種的第5天和第7天，褐色同心輪紋逐漸擴大，且病斑顏色變至深褐色，水漬狀面積擴大，具有酸臭味道（圖3-E、圖3-F），這與梨輪紋病田間發(fā)病癥狀一致。再次通過分離純化得到與ZT98菌落形態(tài)一致的菌株，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落逐漸由淺灰色變成深灰色，（圖3-I、圖3-J、圖3-K、圖3-L）。因此，本研究明確ZT98是雪梨果實輪紋病的致病菌株。

2.4 菌株ZT98的分子生物學鑒定

通過對菌株ZT98的rDNA-ITS序列（約550 bp）在NCBI網(wǎng)站的Genebank獲得登錄號（OR054159），經(jīng)基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，ZT98與葡萄座腔菌（B. dothidea）聚于同一分支，同源性高達100%（圖4），說明采樣梨園輪紋病致病菌種類單一，無多種病原菌復合侵染。因此，天津地區(qū)雪梨果實輪紋病病原菌為葡萄座腔菌（B. dothidea）。

3 討論與結(jié)論

我國是世界上梨種植和生產(chǎn)大國，隨著種植面積的增大，梨常遭受多種病原菌的威脅，輪紋病是限制梨產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展的重要病害之一，其分布廣泛，嚴重時造成絕產(chǎn)。輪紋病的病原菌擴展到木質(zhì)部后，影響水分和養(yǎng)分的運輸，導致梨樹樹勢削弱，或枯萎死亡。輪紋病病原菌在梨樹內(nèi)可存活6年之久，還可侵染蘋果、山楂、杏、桃、棗等多種果樹，一旦發(fā)病應(yīng)及時刮除病原殘體，并選育抗病品種[13-14]。輪紋病病害以化學防治為主，多菌靈、烯唑醇或苯醚甲環(huán)唑等均具有較好的防效[15-17]。生物防治能有效減少化學藥劑的使用量并緩解抗藥性，但目前梨輪紋病的生物菌劑如枯草芽孢桿菌和木霉菌等，防治效果仍不穩(wěn)定。

梨輪紋病致病菌的鑒定是有效防治該病害的關(guān)鍵因素之一，天津地區(qū)梨輪紋病致病菌尚無明確分類。本研究將采集自天津市薊州區(qū)梨園果實輪紋病樣品進行了致病菌的分離純化，得到一株真菌ZT98，菌絲有隔，分支頂端尖細，但未發(fā)現(xiàn)分生孢子，與龍瓏等[18]和冷偉鋒等[19]的報道一致。本研究對ZT98的產(chǎn)孢條件進行了摸索，將接種病原菌的雪梨果實置于容器中在自然光下培養(yǎng)，或?qū)⒕逵?5 ℃黑光燈下培養(yǎng)10～20 d，均未觀察到孢子。因此，筆者推測菌株ZT98的產(chǎn)孢條件可能較為苛刻，除溫度和光照外，還可能受到其他環(huán)境因素和生理生化特性的影響，或僅在活體梨樹或果實發(fā)病后期才能產(chǎn)生分生孢子。

依據(jù)柯赫氏法則對分離獲得的菌株進行致病性檢測是病原菌鑒定的關(guān)鍵。因菌株的致病性受到環(huán)境、寄主品種等多種因素的影響，有多種植物病害病原物即使在田間有明顯的致病力，但在實驗室條件下致病性會減弱或失去致病力[20]。將分離得到的菌株ZT98回接到雪梨果實后出現(xiàn)的癥狀與采集樣品癥狀一致，因此推測ZT98是雪梨果實輪紋病的致病菌。進一步分析菌株ZT98與其他地區(qū)梨或蘋果輪紋病致病菌基因組序列的差異基因，篩選與致病性或癥狀有關(guān)的關(guān)鍵基因，能為梨輪紋病抗性基因篩選和抗病品種的培育提供依據(jù)。

真菌菌落形態(tài)和菌絲結(jié)構(gòu)特征常受到培養(yǎng)條件的影響，導致植物病原真菌鑒別存在一定差異[21]，因此依據(jù)癥狀、菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征進行病原菌的鑒定是不充分的，難以明確到種或亞種[22-23]。而已發(fā)展成熟且靈敏的分子生物學技術(shù)分析菌株ZT98的ITS序列是本研究中雪梨果實輪紋病致病菌鑒定的關(guān)鍵[24-25]。通過分析看家基因?qū)⒉≡镨b定到種或亞種，是致病菌鑒定分類的常用技術(shù)。但葡萄座腔菌屬的看家基因EF1-α、GPD、HSP或H3等作為種類鑒定的依據(jù)仍存在一定的爭議[26]。梨輪紋病致病菌自然界常見的無性態(tài)為輪紋大莖點霉（Macrophoma kuwatsukai Hara.）[27]，有性態(tài)致病菌B. dothidea主要通過皮孔和傷口侵染梨樹樹干或果實形成典型的枝干或果實輪紋癥狀。濕度大的條件下引起梨或蘋果的輪紋病癥狀，干燥條件下引起果樹干腐癥狀[12]。在美國梨輪紋病的致病菌是B. dothidea [28]，B. dothidea包括4個基因型，引起蘋果輪紋病的病原菌包括2種，即B. kuwatsukai和B. dothidea。我國梨輪紋病致病菌分為2種基因型，分別是B. berengeriana 和 B. dothidea，它們致病性存在一定分子分化，但被證實ITS及看家基因的序列一致，均被命名為B. dothidea [9]。因此，本研究分離純化了一株天津薊州地區(qū)梨輪紋病病原菌，并結(jié)合形態(tài)學特征和ITS基因序列分析，明確了該病致病菌是B. dothidea，為梨輪紋病病害的精準診斷、抗病品種篩選和有效防治奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 陳策. 蘋果果實輪紋病研究進展[J]. 植物病理學報， 1999， 29（3）： 193-198.

[2] 董金皋. 農(nóng)業(yè)植物病理學[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2001.

[3] 王文青， 李揚， 向均， 等. 我國梨產(chǎn)區(qū)引起黑斑病的鏈格孢種類鑒定與致病性研究[J]. 果樹學報， 2020， 37（12）： 1922-1933.

[4] 鄧一文， 劉裕強， 王靜， 等. 農(nóng)作物抗病蟲研究的戰(zhàn)略思考[J]. 中國科學（生命科學）， 2021， 51（10）： 1435-1446.

[5] TANG W， DING Z， ZHOU Z Q， et al. Phylogenetic and pathogenic analyses show that the causal agent of apple ring rot in China is Botryosphaeria dothidea[J]. Plant Disease， 2012， 96（4）： 486-496.

[6] 張璐， 劉奇志， 張國珍. 6種梨果實對輪紋病的抗性差異及4種殺菌劑對輪紋病菌的抑菌作用[J]. 植物保護， 2019， 45（4）： 224-228.

[7] 劉曉琳， 馬麗亞， 劉煥祿. 天津地區(qū)蘋果輪紋病防治的室內(nèi)藥劑篩選試驗研究[C]//園藝學進展. 西安： 陜西科學技術(shù)出版社， 2004： 339-340.

[8] ZHAI L F， ZHANG M X， LV G， et al. Biological and molecular characterization of four Botryosphaeria species isolated from pear plants showing stem wart and stem canker in China[J]. Plant Disease， 2014， 98（6）： 716-726.

[9] MARSBERG A， KEMLER M， JAMI F， et al. Botryosphaeria dothidea： a latent pathogen of global importance to woody plant health[J]. Molecular Plant Pathology， 2017， 18（4）： 477-488.

[10]? 呂剛. 我國梨樹輪紋病和干腐病病原菌的遺傳多樣性及分子特點研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2012.

[11] 肖峰. 我國梨輪紋病病原鑒定與BkLiP1基因功能研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2022.

[12] 翟立峰. 梨輪紋病與干腐病的病原關(guān)系及輪紋病菌攜帶真菌病毒多樣性研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2016.[13] 彭斌， 劉麗鋒， 吳會杰， 等. 蘋果輪紋病菌種內(nèi)遺傳多樣性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2011， 44（6）： 1125-1135.

[14] 鄧輝. 天津薊州梨樹主要病蟲害的發(fā)生與防治[J]. 果樹實用技術(shù)與信息， 2023（5）： 36.

[15] 丁芳兵. 梨輪紋病生防菌株的篩選及其防治作用的研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[16] 張麗麗. 梨輪紋病菌生物學特性及其果實病害生物防治研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[17] 趙杰， 趙寶明， 陸曉莉， 等. 梨輪紋病菌的生物學特性及藥劑的毒力測定[J]. 上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版）， 2016， 34（3）： 79-84.

[18] 龍瓏， 周澤科， 蔣軍喜. 南昌市郊梨輪紋病病原菌鑒定[J]. 中國南方果樹， 2012， 41（4）： 36-38.

[19] 冷偉鋒， 李保華， 國立耘， 等. 蘋果輪紋病菌誘導產(chǎn)孢方法[J]. 植物病理學報， 2009， 39（5）： 536-539.

[20] 何開平， 吳楚， 張俊偉. 崇陽縣梨輪紋病病原菌鑒定及生物學特性[J]. 中國植保導刊， 2013， 33（11）： 17-21.

[21] TAYLOR J W， JACOBSON D J， KROKEN S， et al. Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi[J]. Fungal Genetics and Biology， 2000， 31（1）： 21-32.

[22] 汪來寶， 付艷蘋， 劉信強. 砂梨果實輪紋病病原鑒定及抑菌藥劑的篩選[J]. 中國果樹， 2018（5）： 15-18， 22.

[23] 張麗麗， 常有宏， 陳志誼. 梨輪紋病菌培養(yǎng)特性研究[J]. 果樹學報， 2009， 26（4）： 520-524.

[24] 吳良慶， 朱立武， 衡偉， 等. 碭山梨炭疽病病原鑒定及其抑菌藥劑篩選[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2010， 43（18）： 3750-3758.

[25] 趙杰. ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應(yīng)用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學， 2004， 50（4）： 35-37.

[26] CHETHANA K W T， LI X H， ZHANG W， et al. Trail of decryption of molecular research on Botryosphaeriaceae in woody plants[J]. Phytopathologia Mediterranea， 2016， 55（2）： 147-171.

[27] 劉郵洲， 常有宏， 魏本強， 等. 梨輪紋病拮抗細菌的篩選與評價[J]. 果樹學報， 2009， 26（3）： 344-348， 262.

[28] 肖峰， 王國平， 洪霓. 我國梨樹輪紋病和干腐病病原菌種內(nèi)遺傳多樣性研究[C]//中國植物病理學會2017年學術(shù)年會論文集. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社， 2017： 154.