紫花地丁輻照前、后鎮(zhèn)痛、抗炎及抗菌活性對比研究

顏宏 柴琇瑛 趙道強 郭琰 李婷 鐘承志 吳德松

摘要：目的 對紫花地丁輻照前、后樣品的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌活性和安全性進行對比研究。方法 采用最大給藥量法測定輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥的急性毒性；采用醋酸致小鼠疼痛模型、二甲苯致小鼠耳腫模型和最小抑菌濃度（MIC）值測定實驗，對比紫花地丁輻照前、后樣品的藥效學活性。結果 小鼠急性毒性實驗結果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥最大給藥量為24 g/kg，小鼠灌胃后的毒性反應主要為腹瀉癥狀，于給藥后第2日恢復正常，二者在安全性方面無明顯差異。藥效學研究結果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品均可顯著降低醋酸致小鼠扭體反應次數(shù)、抑制二甲苯致小鼠耳腫，并在體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和肺炎鏈球菌均具有一定的抑制作用，且輻照前、后樣品抑制作用一致，最小抑菌濃度MIC值分別為2.5、2.5、1.25、1.25 mg/mL。從藥效活性來看，二者無明顯差異。結論 紫花地丁輻照前、后樣品在安全性和藥效學活性方面均無明顯差異，初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

關鍵詞：紫花地?。惠椪諟缇?；急性毒性試驗；安全性；抗炎；鎮(zhèn)痛；抗菌

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）09-0001-03

輻照滅菌技術利用電離輻射（主要指60Co-γ射線、加速器產(chǎn)生高能電子束或轉換成的X射線）與物質相互作用產(chǎn)生的物理、化學和生物效應，抑制微生物遺傳物質合成，從而達到滅菌效果［1］。它是一種新型、高效的滅菌方法，尤其是對揮發(fā)性、熱敏性中藥，表現(xiàn)出了優(yōu)越性，已成為傳統(tǒng)中藥滅菌的重要補充方法［2］。它的特點是穿透力強，可有效避免藥品或藥材在使用之前的二次污染；可在常溫下進行，不會明顯升高被輻照物的溫度，是熱敏藥物的最佳滅菌方法［3］；同時，輻照滅菌操作簡便、速度快，輻照后可立即使用，無需靜置或冷卻，可實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。[KG）]

紫花地?。╒iola yedoensis）是堇菜科多年生草本植物，性寒味苦，在民間有著悠久的用藥歷史，在中國傳統(tǒng)醫(yī)用上，紫花地丁主要以全草入藥，主要用于抗菌消炎、清熱解毒和涼血消腫，同時外用治療濕疹、瘙癢和粉刺等皮膚病?，F(xiàn)代醫(yī)用上發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗病毒、抗炎、抑菌和抗腫瘤活性，臨床上多用于治療疔瘡腫毒、尿路感染、蜂窩組織炎、乳腺炎和咽炎等，外用治療癰腫、跌打損傷和毒蛇咬傷等。由此可見，紫花地丁有著很高的開發(fā)價值［1］。為了滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需要，我們將紫花地丁的滅菌方式改為輻照滅菌，但是對于不同的藥材，其最佳的輻照劑量不同，輻照劑量過大會引起個別中藥化學成分、生物活性的變化。參照《中藥輻照滅菌技術指導原則》的相關規(guī)定和紫花地丁的臨床應用［4，5］，我們對紫花地丁輻照前后樣品的安全性、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌活性進行了初步評價，為其工藝改進提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 受試樣品 紫花地丁干燥全草，由云南白藥集團中藥資源事業(yè)部提供，批號：2018120503-1。樣品制備方法：取紫花地丁干燥全草，粉碎后過150目篩，過篩率67.13%，灰綠色粉末，批號：YC2421301，為紫花地?。ㄝ椪涨埃悠?。取紫花地丁干燥全草，經(jīng)60Co輻照滅菌（輻照劑量為20 kGy），粉碎后過150目篩，過篩濾66.77%，灰綠色粉末，批號：YC2421301，為紫花地丁（輻照后）樣品。兩樣品均由云南省藥物研究所天然藥物化學研究室提供，常溫、密封、干燥保存。

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213，批號：010123；大腸埃希菌Escherichia coli ATCC25922，批號：010888；白色念珠菌Candida albicans ATCC10231，批號：016783；肺炎鏈球菌Streprococcus neumonia ATCC49619，批號：010123，均購自美國特種生物貯藏中心。

1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基配制：精確稱取酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，氫氧化鈉40.0 mg，溶于純水并用容量瓶定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后備用。MUELLER-HINTON BROTH（MH）液體培養(yǎng)基配制：精確稱取21.0 gMH粉末溶于純水并用容量瓶定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后備用。

1.4 實驗動物 SPF級KM小鼠，體質量18～22 g，共156只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。本單位實驗動物使用許可證：SYXK（滇）K2017-0004，發(fā)證單位：昆明市科技局。實驗動物經(jīng)云南省藥物研究所實驗動物管理與使用委員會（IACUC）審查同意，動物倫理編號：動（倫）IACUC-2018-023-01。

1.5 主要儀器 JJ2000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn)；SQP型電子分析天平，賽多利斯（北京）科學儀器有限公司生產(chǎn)；Multiskan GO型全波長酶標儀，美國Thermo公司生產(chǎn)；THZ-D型臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設備廠。

1.6 主要試劑 冰醋酸，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，批號：1211011；二甲苯，重慶川東化工（集團）有限公司生產(chǎn)，批號：20140701；阿司匹林腸溶片，拜耳醫(yī)藥公司生產(chǎn)，BJ24851；注射用美羅培南，住友制藥（蘇州）有限公司，批號：2160c。

2 實驗方法

2.1 小鼠灌胃給藥急性毒性試驗 在開展小鼠急性毒性正式試驗前，首先摸索紫花地丁輻照前、后樣品可配制出的，且利于動物灌胃給藥的最大濃度（濃度過高可能堵塞灌胃針）。用電子天平精確稱取紫花地丁輻照前、后樣品各10.00 g于研缽中，加入少量純水充分研磨均勻，并將研磨后的混懸液移入量筒中；再用純水多次洗凈研缽，并將混懸液移入量筒中，最終體積約為50 mL，此時兩樣品的濃度為0.2 g/mL；在正式試驗時，小鼠以40 mL/kg給藥體積灌胃給藥，則給藥劑量為8 g/kg。

正式試驗時，參照文獻方法［6］，取SPF級KM小鼠60只，隨機分為空白組、紫花地?。ㄝ椪涨埃?4 g/kg（單次最大給藥劑量為8 g/kg，給藥3次）、紫花地?。ㄝ椪蘸螅?4 g/kg劑量組（單次最大給藥劑量為8 g/kg，給藥3次），每組20只，雌雄各半。禁食不禁水6 h后，各組以40 mL/kg給藥體積灌胃給予相應受試樣品，間隔4 h給藥1次，共給藥3次。給藥當天觀察并記錄動物4 h內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應和死亡情況；以后每天觀察1次，連續(xù)14 d。主要觀察動物飲食、一般狀態(tài)、行為活動、排泄物等是否異常和死亡情況。在給藥前、給藥后第3、7和14 d對動物稱重并對體質量進行統(tǒng)計學分析。觀察14 d后結束頸椎脫臼處死動物，解剖后肉眼觀察動物臟器、組織的體積、顏色、質地等有無異常。

2.2 醋酸致小鼠疼痛 參照文獻方法［7］，取SPF級KM小鼠96只，全雄性，隨機分為溶媒對照組、阿司匹林0.4 g/kg組、紫花地?。ㄝ椪涨埃?.5、1.0、2.0 g/kg劑量組，紫花地?。ㄝ椪蘸螅?.5、1.0、2.0 g/kg劑量組，每組12只。各組小鼠均以20 mL/kg的給藥體積灌胃給予相應受試物，溶媒對照組給予等體積純水，每天一次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，以10 mL/kg給藥體積腹腔注射0.62%冰醋酸，10 min后觀察小鼠在15 min內(nèi)的扭體反應次數(shù)（以小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張，臀部抬起反應為準），并對結果進行統(tǒng)計學分析。

2.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 參照文獻方法［8-9］，動物分組、劑量設定和給藥頻次均同2.2所述。末次給藥后1 h，各組小鼠在右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.04 mL，左耳不涂抹作為對照。致炎后1 h脫頸椎處死小鼠，用眼科剪剪下小鼠雙耳，直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，稱取耳片重量，以兩耳片重量之差作為腫脹度，并進行統(tǒng)計學分析。

2.4 體外對常見病原致病菌MIC值測定 參照文獻方法［10-11］，分別從菌落平板上挑取金黃色葡萄球菌ATCC29213單克隆接種于MH液體培養(yǎng)基中，挑取大腸埃希菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、肺炎鏈球菌ATCC49619單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；而后再分別接種于MH、LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。各菌活化后，將細菌濃度調整為1×105 CFU/mL，接種入96孔培養(yǎng)板中。第1孔內(nèi)加入190 μL菌液，第2～12孔內(nèi)均加入100 μL菌液。分別將受試樣品或美羅培南10 μL加入第1孔中，混勻后吸取100 μL菌液加入第2孔中，依次對倍稀釋，重復3次。同時，設立陽性對照、陰性對照、溶劑對照。其中，陽性對照僅加入相應濃度菌液，陰性對照直接加入培養(yǎng)基，溶劑對照加入相應濃度菌液和生理鹽水。培養(yǎng)板分別置于37 ℃養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)12 h，溶液清亮表示陰性（-），溶液混濁表示陽性（+）；讀出抑制細菌生長的最低樣品濃度（Minimal Inhibition Concentration，MIC）即為最小抑菌濃度。

2.5 統(tǒng)計學方法 通過SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 小鼠急性毒性試驗 溶媒對照組所有動物給予純水后一般狀況良好，均未見明顯異常反應和死亡情況。小鼠灌胃給予紫花地丁輻照前、后樣品后，在4 h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應，其中紫花地?。ㄝ椪涨埃?4 g/kg劑量組4只雌性小鼠和2只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，紫花地?。ㄝ椪蘸螅?4 g/kg劑量組3只雌性小鼠和3只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，剩余動物均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的異常反應。毒性反應在給藥后第2日恢復正常。觀察期14 d內(nèi)，各組動物均未見明顯毒性反應和死亡情況。觀察期結束后處死動物大體解剖觀察，各組動物組織和器官均未見明顯異常。結果顯示，各組小鼠在給藥后均未出現(xiàn)死亡，結果以最大給藥量表示。紫花地丁輻照前、后樣品小鼠24 h急性毒性試驗的最大給藥量均為24 g/kg（8 g/kg/次，共灌胃3次，間隔4 h），相當于成人每日口服紫花地丁輻照前、后樣品184.62 g（按體表面積折算，成人體重以60 kg計算）。觀察期內(nèi)動物體質量變化情況見表1。

3.2 對醋酸所致小鼠疼痛的影響 試驗結果顯示：與溶媒對照組比較，紫花地丁輻照前、后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠扭體反應次數(shù)明顯減少（P<0.01）。與紫花地?。ㄝ椪涨埃悠方M比較，紫花地?。ㄝ椪蘸螅悠方M小鼠扭體反應次數(shù)均無明顯變化（P>0.05），結果見表2。

3.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 試驗結果顯示：與溶媒對照組比較，紫花地丁輻照前、輻照后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠耳腫脹度明顯減輕（P<0.01）。與紫花地?。ㄝ椪涨埃悠方M比較，紫花地?。ㄝ椪蘸螅悠方M小鼠耳腫脹度均無明顯變化（P>0.05），結果見表3。

3.4 對常見病原致病菌MIC值的測定 試驗結果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌均具有一定抗菌作用，且重復三次結果一致，其MIC值見表4。

4 小結

輻照滅菌技術已發(fā)展了近40年，在食品和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中廣泛應用［12］，但輻照滅菌對中藥材化學成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確。由于缺乏相應的行業(yè)標準及指導原則，輻照滅菌過程中存在超劑量輻照、重復輻照等問題，嚴重影響了藥品的質量。已經(jīng)出現(xiàn)擅自改變產(chǎn)品滅菌工藝，而被CFDA收回藥品GMP證書的事件［13］。為解決這一問題，CFDA于2015年發(fā)布《中藥輻照滅菌技術指導原則》，其中明確提出，輻照滅菌應遵循“必要、科學、合理”的原則。任何單位或藥企采用輻照技術對中藥進行滅菌，必須通過研究來證明輻照滅菌對產(chǎn)品質量、穩(wěn)定性和生物學性質沒有影響，必要時采用與適應證相關的藥效指標，詳細闡述其必要性、科學性和合理性；對于含有不穩(wěn)定或有毒成分的中藥，更需進行針對性研究，關注其滅菌前后的變化情況，以保證藥品安全有效［14］。

基于上述規(guī)定，本研究結合紫花地丁的現(xiàn)代藥理學活性，對比了輻照前后紫花地丁樣品在初步安全性和鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌方面的活性。其中，急性毒性試驗結果表明，20 kGy輻照劑量照射紫花地丁后，樣品對小鼠的急性毒性未發(fā)生重大改變。有效性研究結果顯示：輻照前后紫花地丁均可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應和二甲苯所致小鼠耳腫，均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛抗炎活性；且輻照前后紫花地丁對4株常見菌株具有一定的抑制作用，輻照后紫花地丁的藥效學活性無顯著改變。綜上所述，在此輻照劑量對紫花地丁的安全性和有效性均無明顯改變，初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

輻照滅菌對中藥材化學成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確，本實驗結果表明，紫花地丁輻照滅菌后，在有效性和安全性方面與輻照前沒有發(fā)生改變，因此在紫花地丁生產(chǎn)過程中，可用輻照滅菌法進行滅菌處理，而輻照滅菌對其化學成分有無影響，還需要進一步研究。

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