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    迷迭香酸通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制喉癌細胞的增殖和遷移

    2023-10-03 09:39:34楊花榮王娜娜
    局解手術學雜志 2023年9期
    關鍵詞:劃痕低劑量批號

    延 青,楊花榮,王娜娜

    (延安大學附屬醫(yī)院鼻咽喉科,陜西 延安 716000)

    喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,主要病理類型為喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)。由于該病早期通常無明顯臨床癥狀,大多數(shù)LSCC 患者就診時已處于具有高侵襲性的晚期階段[1]。盡管手術和放療可以延長LSCC 患者的生存期,但仍有約30%的患者出現(xiàn)復發(fā)或轉移。腫瘤侵襲轉移是導致LSCC 患者生存率低的主要原因[2-3]。因此,迫切需要尋找更有效的治療策略。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一種常見于唇形科植物中的酚類化合物[4],具有抗癌活性,能有效抑制肝癌[5]、乳腺癌[6]細胞的增殖和遷移,還可以調節(jié)與細胞增殖、侵襲相關的信號通路。據(jù)報道,RA 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[7]。但RA 是否能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制LSCC細胞惡性進展仍不清楚。因此,本研究主要通過觀察RA對LSCC細胞增殖和遷移的影響,分析其潛在機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥物及細胞

    RA(批號:M-024)購自成都瑞芬思生物科技有限公司,純度≥98%。人LSCC細胞系Hep-2(批號:CCL-23)購自美國ATCC 細胞庫;人LSCC 細胞系TU686(批號:A3079)購自上海酶研生物科技有限公司。

    1.2 主要試劑及儀器

    CCK-8 試劑盒(批號:210508)購自北京索萊寶科技有限公司;細胞總蛋白提取試劑盒(批號:20200815)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;BCA試劑盒(批號:210317)購自上海碧云天生物公司;Ki-67、MMP-2、MMP-9、GAPDH 兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗(批號:20210506、20210814、20210913、20210425、20211004)均購自英國Abcam 公司;PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR(批號:210807、210705、210413、210610、210920、210924)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活劑胰島素生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)重組蛋白(批號:211104)購自美國Med Chem Express公司。

    細胞培養(yǎng)箱(型號:LW-80A-Ⅲ)購自上海利聞科學儀器有限公司,酶標儀(型號:BIO-RAD-550)購自北京京科瑞達科技有限公司。

    1.3 細胞培養(yǎng)、分組與形態(tài)觀察

    將Hep-2 和TU686 細胞置于含有10% FBS 與90%DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2條件下進行常規(guī)傳代培養(yǎng),每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的Hep-2和TU686 細胞,于添加20 μmol/L RA、50 μmol/L RA、100 μmol/L RA、10 nmol/mL IGF-1、10 nmol/mL IGF-1+100 μmol/L RA 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h[7],分別作為低劑量組、中劑量組、高劑量組、IGF-1 組、IGF-1+RA 組,另設置對照組(正常培養(yǎng)的對數(shù)生長期的Hep-2 和TU686細胞)。培養(yǎng)48 h后,使用倒置顯微鏡觀察各組Hep-2和TU686細胞形態(tài),并拍照。

    1.4 檢測細胞增殖能力

    將各組Hep-2 和TU686 細胞以2×105個/孔接種到24 孔板中,每組分別設置6 個復孔,按照1.3 項下方法分組處理48 h,然后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液,5% CO2、37 ℃孵育2 h,利用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度。

    1.5 檢測細胞遷移能力

    取對數(shù)生長期的各組Hep-2 和TU686 細胞,消化重懸。細胞以2×105個/孔的密度培養(yǎng)于24 孔板中,待細胞貼壁后,每孔劃出相等距離線條,于37 ℃、5% CO2的條件下持續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照,測量劃痕距離,計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h的劃痕距離-48 h的劃痕距離)/0 h的劃痕距離×100%。

    1.6 檢測蛋白表達水平

    使用RIPA 裂解緩沖液提取細胞中總蛋白。通過BCA 試劑盒測定蛋白濃度,平衡蛋白濃度后,使用10% SDS-PAGE 進行電泳分離獲得蛋白,并轉至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后,加入一抗PI3K(1∶3 000)、AKT(1∶3 000)、mTOR(1∶1 000)、p-PI3K(1∶3 000)、p-AKT(1∶3 000)、p-mTOR(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-2(1∶2 500)、MMP-9(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜,再加入羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h。使用ECL 化學發(fā)光試劑盒將蛋白可視化,通過Image J軟件對目標條帶的灰度值進行分析。

    1.7 統(tǒng)計學分析

    使用SPSS 25.0 軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,結果均以均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組Hep-2和TU686細胞形態(tài)

    與對照組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686 細胞數(shù)量均減少,細胞嚴重皺縮,并有大量細胞碎片出現(xiàn),且RA 濃度越高,Hep-2 和TU686細胞數(shù)量越少;而IGF-1組Hep-2和TU686細胞數(shù)量增多,細胞形態(tài)無明顯改變;與高劑量組比較,IGF-1+RA組Hep-2 和TU686 細胞數(shù)量增多,貼壁細胞數(shù)更多,見圖1。

    圖1 各組Hep-2和TU686細胞形態(tài)(×400)

    2.2 各組Hep-2和TU686細胞增殖能力

    與對照組比較,在48 h 時低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2和TU686細胞OD450值顯著降低(P<0.05),而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細胞OD450值顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,在48 h 時IGF-1+RA 組Hep-2和TU686細胞OD450值顯著升高(P<0.05),見圖2。

    圖2 各組Hep-2和TU686細胞的增殖活性

    2.3 各組Hep-2和TU686細胞遷移能力

    與對照組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2和TU686細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,IGF-1+RA 組Hep-2 和TU686細胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05),見圖3。

    圖3 各組Hep-2和TU686細胞愈合率比較

    2.4 各組Hep-2 和TU686 細胞中增殖、遷移相關蛋白表達情況

    與對照組比較,中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686 細胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,IGF-1+RA 組Hep-2 和TU686 細胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖4~5。

    圖4 各組Hep-2細胞中增殖、遷移蛋白表達

    圖5 各組TU686細胞中增殖、遷移蛋白表達

    2.5 各組Hep-2 和TU686 細胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關蛋白表達情況

    與對照組比較,中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平顯著降低(P<0.05),而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 水平顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,IGF-1+RA組Hep-2和TU686 細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平顯著升高(P<0.05),見圖6~7。

    圖6 各組Hep-2細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白

    圖7 各組TU686細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白

    3 討論

    LSCC發(fā)展到晚期時,較差的預后和有限的治療方式對患者生命造成嚴重威脅[8-10]。因此,尋找安全、有效、低毒的治療藥物具有重要意義。RA 作為一種天然活性成分,具有廣泛的生物學活性,如抗炎、抗氧化、抗感染和保肝[11-12]。此外,RA 對多種惡性腫瘤(如乳腺癌[6]、肝癌[7]、結直腸癌[13]和黑色素瘤[14])的惡性進展具有抑制作用。本研究結果顯示,RA 可抑制Hep-2和TU686 細胞增殖、遷移,這與上述研究一致。有研究證實Ki-67 在癌組織中高表達,參與癌癥的發(fā)展進程[15];MMP-2、MMP-9 在癌細胞中高表達,能有效促進癌細胞的遷移和侵襲,導致癌癥惡化[16]。本研究結果顯示,RA能降低Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平,表明RA 能夠有效抑制LSCC 細胞的增殖和遷移,提示RA可能是LSCC的潛在治療藥物。

    PI3K/AKT/mTOR 信號通路在癌癥進展中具有關鍵作用,可調控多種過程,包括新陳代謝、細胞生長、存活、遷移和分化[17-18]。研究顯示,PI3K/AKT/mTOR 信號通路的過度激活,參與多種癌癥進展[19-20]。因此,PI3K/AKT/mTOR 信號通路被認為是治療癌癥的重要靶點。有研究報道,RA 在體內外抑制肝癌細胞增殖、侵襲和腫瘤生長的作用與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活密切相關[7]。本研究發(fā)現(xiàn),中、高劑量的RA可顯著降低Hep-2和TU686細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的蛋白表達水平,表明RA 可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活。因此,可以推測RA 對LSCC細胞惡性生物學行為的抑制作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路有關。為了驗證這一機制,本研究在RA 處理的基礎上,使用PI3K/AKT/mTOR 激活劑IGF-1 進行干預,結果顯示,IGF-1 可以有效減輕RA 對LSCC 細胞惡性生物學行為的抑制作用。提示RA 對LSCC 細胞增殖、遷移的抑制作用可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路實現(xiàn)的。

    綜上所述,RA 可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路,從而抑制LSCC 細胞增殖、遷移。本研究進一步明確了RA 發(fā)揮抗LSCC 作用的分子機制,為RA 的應用提供理論依據(jù),表明RA 有望成為LSCC 的潛在治療藥物。但需要進一步的體內實驗研究來驗證RA 對LSCC的抗癌作用。

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