絕經綜合征患者腸道菌群結構變化及桂仙合劑的干預作用*

毛婷，劉雅倩，宗云，周英

1 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 廣東廣州 510405

2 東莞市婦幼保健院 廣東東莞 523057

3 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 廣東廣州 510405

絕經綜合征（menopausal syndrome，MPS）指婦女絕經前后出現性激素波動或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀[1]。早期表現以月經紊亂、血管舒縮癥狀及自主神經功能失調為主，如潮熱、出汗、煩躁、失眠等癥狀；遠期可并發(fā)心血管病變、骨質疏松、阿爾茨海默病、泌尿生殖道癥狀等[2]。根據世界衛(wèi)生組織數據，到2030年全球將有超過12億絕經婦女，中國將超過2.1億，其中將有69.5%～80%的婦女被MPS困擾[3-4]。課題組前期臨床研究表明桂仙合劑（Gui Xian Decoction，GXD）治療MPS有良好療效[5]，但作用機制尚不明確。近年來，基于16S rRNA測序技術探究腸道菌群與疾病的相關性、腸道菌群與藥物作用機制的相關研究已成為焦點，但目前國內外研究MPS與腸道菌群的相關研究較少，研究的深入性亟待提高，而中藥在調節(jié)腸道菌群方面優(yōu)勢巨大[6-8]，GXD是否可以通過調節(jié)腸道菌群結構治療MPS有待被揭曉。本研究基于16S rRNA測序技術探究MPS患者腸道菌群結構特點及中藥復方GXD干預后腸道菌群的變化，分析GXD治療MPS的作用機制，為臨床治療MPS提供新思路。

資料與方法

1 入組標準

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷 參照《婦產科學》（第9版）[1]的有關內容擬定：①40～60歲女性；②月經紊亂或停閉；③有植物神經改變（潮熱、盜汗、失眠、煩躁等癥狀，有其中一個或多個癥狀）；④促卵泡生成素（FSH）水平升高，雌二醇（E2）水平降低。

1.1.2 中醫(yī)診斷 參照馬寶璋主編《中醫(yī)婦科學》[9]擬定腎陰陽虛證候：潮熱汗出，腰膝酸軟，頭暈耳鳴，五心煩熱，舌苔薄，脈沉弱或細。

1.2 納入標準 E組必須符合以下標準：①符合中西醫(yī)診斷標準；②國內改良的Kupperman Index（KI）評分≥15分；③簽署知情同意書者。H組必須符合以下標準：①40-60歲女性；②改良KI評分＜15分；③簽署知情同意書者。

1.3 排除標準 ①診斷考慮子宮平滑肌瘤（有一條徑線＞3cm），或子宮內膜異位癥，或雙側卵巢切除，或重度乳腺增生，或生殖系統(tǒng)惡性腫瘤者；②原因不明的陰道不規(guī)則流血未治愈者；③合并有心腦血管、肝、腎、內分泌和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病或精神病者；④近3個月內使用過性激素藥物者；⑤存在影響口服藥物吸收的狀況者（例如胃切除術）；⑥過敏體質患者；⑦近2周內使用過抗生素者。只要符合以上其中一項即排除。

2 一般資料

選取2020年6月—2021年8月就診于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的MPS患者35名作為MPS組（E組，n=35），同時招募12名絕經前后健康女性作為健康組（H組，n=12），E組患者在GXD干預后作為治療組（AE組，n=35）。MPS組與H組在身體質量指數（t=0.49，P=0.63）、高血壓患病人數（χ2=0.72，P=0.40）、糖尿病患病人數（χ2=0.35，P=0.55）上均無差異，兩組具有可比性。本研究經廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會（批件號：NO.ZYYECK【2020】021）批準，獲得患者知情同意并簽署知情同意書。

3 治療方法

AE組采用GXD治療，組方：仙茅5g，仙靈脾5g，巴戟天15g，當歸10g，知母5g，黃柏5g，生龍骨30g，生牡蠣30g，龜板20g，桂枝10g，白芍10g，炙甘草10g，大棗10g，生姜10g，連續(xù)服用21d為1療程，停藥7d（治療中斷期），共治療3個療程。

4 糞便標本收集及處理

4.1 糞便標本采集 H組標本于招募后第2天采集，E組標本在中藥干預前1周內采集，AE組標本在中藥干預后1周內采集。標本均在非經期清晨空腹狀態(tài)下，用竹簽挑取2~3g糞便放置在無菌便盒中，做好相對應標記后，于-80 ℃冰箱保存。

4.2 糞便細菌DNA提取及測序分析 以DNA提取試劑盒提取糞便標本細菌基因組DNA后，采用lllumina MiSeq/Novaseq測序平臺進行雙端測序。采用Qiime2軟件中的DADA2插件對所有標本的全部原始序列進行質量控制、去噪、拼接及去嵌合體，使數據達到分析要求后獲得擴增特征序列（Amplicon Sequence Variant，ASV）。將序列比對到 SILVA數據庫（13.8版本），得到物種的分類信息表，并根據分類數據進行多樣性分析、差異分析及功能預測。

5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布時，兩組間比較采用t檢驗，3組間比較采用one-way ANOVA；計量資料不符合正態(tài)分布時，兩組間比較采用Wilcox秩和檢驗，3組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，并采用Dunnett法進行多重比較。計數資料以頻數或百分率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗。采用ANOSIM分析比較組間和組內差異的大小。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 3組患者腸道菌群擴增特征序列分析

將3組共82份糞便樣本在屬水平上以100%相似度進行聚類，共獲得注釋擴增特征代表序列（Amplicon Sequence Variant，ASV）25033個。繪制可直觀表現3組ASV數目組成特異性及相似性的Venn圖（圖1A），結果顯示：E組、AE組、H組的ASV數目分別為8537、13564、3080，其中，每組特異的ASV數目分別為8424、13462、3028，3組共有的ASV數目僅有29個。

圖1 H組、E組和AE組腸道菌群Venn圖及多樣性分析

2 3組腸道菌群多樣性分析

2.1 Alpha多樣性 以Chao1指數（圖1B）衡量腸道菌群物種豐富度，以Simpson指數（圖1C）衡量菌群多樣性，Shannon指數（圖1D）在評估菌群多樣性時綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，能更加真實地展示3組腸道菌群多樣性[10]。結果 顯示：E組與AE組間Chao1指數、Simpson指數及Shannon指數均有顯著差異（Wilcoxon Test，P＜0.05），而E組與H組、AE組與H組間3個指數均無顯著差異（Wilcoxon Test，P＞0.05）。

2.2 Beta多樣性 以Weighted Unifrac距離計算方式進行主坐標分析 （principal coordinates analysis，PCoA，圖1E）及非度量多維尺度分析 （non-metric multidimensional scaling，NMDS，圖1F），評估不同分組間腸道菌群結構的多樣性。PCoA結果顯示：E組與AE組有顯著差異（ANOSIM，P=0.014），但AE組與H組之間無顯著性差異（ANOSIM，P＞0.05）。NMDS結果顯示：stress值為0.1237，表明圖形有一定的解釋意義，AE組相較于E組腸道菌群的多樣性發(fā)生顯著性變化，且與H組無顯著性差異。

3 3組患者腸道菌群物種組成

將3組腸道菌群ASV的物種注釋及豐度信息與SILVA數據庫（13.8版本）進行比對獲得物種注釋信息，以堆疊柱狀圖表示（其中未分類者歸為“Unclassified”，圖中僅展示出相對豐度排名前20的菌，其余歸為“Other”）。

在門水平上，3組樣本共鑒定出58個菌門，名稱在Taxanomy_phylum下列出（圖2A）。3組腸道菌群豐度最高的前3個優(yōu)勢菌門相同，且表達豐度所占百分比均為厚壁菌門（Firmicutes）＞擬桿菌門（Bacteroidetes）＞變形菌門（Proteobacteria），但3個優(yōu)勢菌門在不同分組的表達豐度所占百分比存在差異。相較于H組，E組厚壁菌門（Firmicutes）/擬桿菌門（Bacteroidetes）值（F/B）降低，但無顯著性差異（ANOVA，P＞0.05）；在GXD干預后比值上升，AE組與E組間有顯著性差異（ANOVA，P=0.023），而與H組無差異（ANOVA，P＞0.05）。

圖2 腸道菌群物種結構分析

在屬水平上，3組樣本共鑒定出687個菌屬，菌屬名稱在Taxanomy_genus下列出（圖2B）。3組豐度最高的前兩個菌屬均為擬桿菌屬（Bacteroides）及糞桿菌屬（Faecalibacterium），其余注釋得到的菌屬在不同組中表達豐度不完全一致。其中經粘液真桿菌屬（Blautia）、另枝菌屬（Alistipes）在AE組中顯著富集（Kruskal-Wallis，P＜0.05），而在H組及E組中表達豐度相對較低。

4 3組患者差異菌群分析

為確定3組間重要的腸道差異菌群，利用線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）進行比較（圖3A，圖中僅展示出相對豐度排名前20的菌）。相較于E組和AE組，H組有36個腸道菌群豐度明顯升高（LDA score＞2，P＜0.05），其中直腸真桿菌屬（Agathobacter）對菌群間顯著性差異影響力最大（LDA score=4.42）；相較于H組及AE組，E組有6個腸道菌群豐度明顯升高（LDA score＞2，P＜0.05）；相較于H組及E組，AE組有76個腸道菌群豐度明顯升高（LDA score＞2，P＜0.05），其中經粘液真桿菌屬（Blautia）對菌群間顯著性差異影響力最大（LDA score=4.04）。

圖3 差異菌群分析

基于負二項分布的DESeq2軟件，以P＜0.05且|log2FC|≥2為條件分別篩選E組與H組、AE組與E組之間的差異腸道菌群（圖3B、圖3C），并觀察相關差異菌群在GXD干預后相較于E組及H組平均豐度的改變（表1）。結果 顯示：E組有6個腸道菌群豐度顯著高于H組，分別是黃桿菌屬（Flavonifractor）、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、Odoribacter菌屬、CAG_352菌屬、丁酸弧菌屬（Butyricimonas）和弧菌屬（Vibrio），在GXD干預后黃桿菌屬（Flavonifractor）、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）豐度上調；有2個腸道菌群豐度顯著低于H組，分別是直腸真桿菌屬（Agathobacter）、梭菌屬（Clostridia_UCG_014），且均在GXD干預后豐度上調。與E組相比，AE組有9個腸道菌群豐度顯著下調，分別是毛螺菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、巨球型菌屬（Megasphaera）、嗜膽菌屬（Bilophila）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、顫螺菌屬（Oscillibacter）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、阿克曼菌屬（Akkermansia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus_gnavus_group），其中嗜膽菌屬（Bilophila）及韋榮氏球菌屬（Veillonella）豐度達到H組水平，而克雷伯氏菌屬（Klebsiella）下調至較H組更低水平。

表1 相關差異菌屬在3組間的平均豐度

5 功能預測

為預測并比較3組間腸道菌群功能，采用PICRUS軟件將3組數據與KEGG數據庫進行比較，得到Level 3層級功能注釋信息，并用Dunn`s test檢驗腸道菌群預測功能在組間是否有顯著性差異（P＜0.05，表2）。結果 顯示：E組與H組相比，脂多糖生物合成顯著增強，并在GXD干預后減弱；而甲狀腺激素信號傳導通路、多巴胺能突觸功能、逆行性的內啡肽信號傳遞功能及羥色胺能突觸功能在GXD干預后顯著增強。

表2 KEGG L3功能預測及組間差異

討 論

腸道中細菌的類型和數量的變化可能導致發(fā)展為不同的疾病[11]，如高血壓、糖尿病、腫瘤等[12-14]。中藥在調節(jié)腸道菌群方面優(yōu)勢巨大，有實驗表明，許多低血藥濃度的中藥成分在腸道的聚集濃度非常高，其與腸道菌群之間的關系密不可分[6]。越來越多的學者注意到腸道微生態(tài)的平衡理論與“調和陰陽，扶正祛邪”的中醫(yī)理論不謀而合，即扶植腸道內的益生菌，抑制有害菌和致病因子，對增強人體雙向調節(jié)能力、提高免疫力及維持身體健康發(fā)揮重要作用[15]。本課題組在前期已證明GXD治療MPS相關癥狀有良好的療效，并認為GXD可能通過調節(jié)腸道菌群發(fā)揮作用[16]。

1 MPS患者腸道菌群特征及GXD干預作用

在Alpha多樣性上，AE組的Chao1指數、Simpson指數及Shannon指數均顯著高于E組，而與H組無差異，說明在GXD干預后，MPS患者的腸道菌群在多樣性及豐富度上均有升高，并與絕經前后健康女性水平趨于一致。Beta多樣性分析也顯示出MPS患者在GXD干預前后的腸道菌群多樣性有顯著差異，即GXD能對MPS患者腸道菌群的多樣性和豐富度產生有效干預作用。

從門水平上分析3組腸道菌群的物種組成，本研究結果發(fā)現，雖然豐度前三的優(yōu)勢菌群相同，但在不同分組中的豐度所占百分比仍有不同。與MPS患者相比，AE組厚壁菌門（Firmicutes） 相對豐度升高而擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度降低，與H組水平相近。F/B是評價腸道菌群失調的指標[17]，在GXD干預后能上調MPS患者腸道菌群F/B值改善腸道菌群失調狀態(tài)。

在屬水平上，我們發(fā)現3組腸道菌群的結構出現顯著差異，故采用LEfSe分析及組間DESeq2進一步篩選3組之間的差異腸道菌群，并觀察GXD干預后對相關差異菌群的影響。直腸真桿菌屬（Agathobacter）和經粘液真桿菌屬（Blautia）均被證實是人體轉化黃酮類化合物的重要腸道菌群[18-19]，兩者豐度均在GXD干預后出現上調，其中經粘液真桿菌屬（Blautia）在AE組中豐度顯著升高。近期研究發(fā)現，經粘液真桿菌屬（Blautia）有益生菌樣特性[20]，還能在厭氧條件下轉化淫羊藿苷，將其代謝為去甲基淫羊藿苷，作用于雌激素受體表現出雌激素作用[19]。GXD方中淫羊藿、知母等富含淫羊藿苷[21-22]，故GXD上調經粘液真桿菌屬（Blautia）豐度可能是減輕雌激素水平降低引起的MPS相關癥狀的原因之一。另外，Golubeva AV等[23]發(fā)現經粘液真桿菌屬（Blautia）與結腸中表達的L-色氨酸羥化酶（Tph1）、5-羥色胺（5-HT）轉運體（Sert）和血紅素酶（Ido1）基因水平之間有很強的相關性：與Tph1基因、Ido1基因呈顯著正相關；與Sert基因呈顯著負相關。因此，經粘液真桿菌屬（Blautia）豐度上調可能引起Tph1基因和Ido1基因表達增多，增強人體腸道內L-色氨酸、5-羥色氨酸（5-HTP）和5-HT的生成和轉化；同時降低Sert基因表達，減少神經突觸對5-HT的重攝取，相對增加血清中5-HT水平。已有研究證明5-HT與情緒、體溫調節(jié)及血管收縮有著密切的關系[24-25]，而MPS患者常伴有潮熱及情志異常（焦慮、抑郁）[2]，故GXD可能通過上調經粘液真桿菌屬（Blautia）豐度，增強人體對L-色氨酸、5-HTP和5-HT的吸收和利用度，以改善MPS患者潮熱癥狀及情志異常。

絕經前后女性脂肪含量顯著增加，呈向心性分布，而這已被證實與心血管疾病風險增加有關[26-27]。本研究發(fā)現GXD干預后可調整MPS患者體內與脂肪合成相關的腸道菌群。霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）被證實與女性脂肪比率呈負相關[28]；嗜膽菌屬（Bilophila）是機會致病菌，與腸道炎癥的加重有密切的關系[29]，其中隸屬于嗜膽菌屬（Bilophila）的wadsworthia菌種被證實能與高脂肪飲食協(xié)同促進更高的炎癥反應，并能促進脂肪肝的發(fā)生[30]。而在GXD干預后能升高MPS患者腸道中的霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）豐度，降低嗜膽菌屬（Bilophila）的豐度，故GXD可能通過調整上述2種腸道菌群在MPS患者腸中的豐度，減少脂肪生成，降低罹患心血管疾病的風險。

此外，GXD有降低MPS患者腸道致病菌的作用，如克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）等[31]在GXD干預后豐度降低，能減少其對身體的毒害作用。

2 GXD調節(jié)MPS患者腸道菌群的機體代謝途徑

脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分，作為一種非特異性抗原，會與宿主效應細胞（主要為巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞）相互作用，分泌一系列生物活性分子，使機體內環(huán)境處于紊亂狀態(tài)[32]。本研究對3組腸道菌群的PICRUS功能預測發(fā)現，MPS患者腸道菌群的脂多糖合成功能顯著增強，可能由于腸道中革蘭氏陰性細菌的異常增多，導致脂多糖過多合成，加重患者內環(huán)境紊亂程度，而該功能在GXD干預后減弱。因此GXD可能通過調整腸道菌群，減少脂多糖合成，改善MPS相關癥狀。

在GXD干預后甲狀腺激素信號傳導通路、多巴胺能突觸功能、逆行性的內啡肽信號傳遞功能、羥色胺能突觸功能顯著增強。甲狀腺激素會降低膽固醇和血壓[33]，且正常的甲狀腺功能對減少腹部肥胖和胰島素抵抗有重要作用[34-35]；抑郁癥的許多癥狀如快感缺乏與多巴胺系統(tǒng)功能障礙有關[36-37]；內啡肽現在被證明可以誘導欣快感，并能改善潮熱癥狀[38]。故GXD可能通過調整MPS患者腸道菌群結構，進而增強上述通路，改善MPS相關癥狀。

3 研究意義及展望

本研究運用16S rRNA測序技術，發(fā)現MPS患者腸道菌群的結構特征異于絕經前后健康女性，出現了明顯的腸道菌群失衡。使用GXD干預后能顯著調整MPS患者腸道菌群結構，并預測出其可能增強部分有益通路功能，為探究GXD治療MPS機制提供了新證據。本研究尚存在一定的不足，如臨床上收集的樣本量較少，可能影響結果的代表性；也缺乏實驗驗證菌群與MPS的直接關系。我們將進一步擴大樣本量進行測序分析，并通過實驗室研究GXD干預后篩選出的關鍵差異菌群對MPS相關癥狀的影響和作用機制。