左西孟旦對(duì)膿毒癥心肌損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

柴鵬程，韓海波，胡振杰，陳玉紅

（1.河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，石家莊 050020；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，石家莊 050011）

膿毒癥是指機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙的一種疾病，?？晌＜吧侵匕Y醫(yī)學(xué)常見(jiàn)的急危重癥，病死率高達(dá)30%[1]。膿毒癥心肌損傷（septic myocardial injury，SMI）是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因之一。根據(jù)研究調(diào)查結(jié)果顯示，膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌損傷，其中40%～50%的患者出現(xiàn)心肌抑制，7%左右的患者出現(xiàn)心力衰竭，未合并心臟損傷患者病死率約為20%，合并心臟損傷患者死亡率大于70%[2]。

SMI 的發(fā)病機(jī)制目前并未完全闡明，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，炎癥、氧化應(yīng)激以及心肌細(xì)胞線粒體能量代謝障礙是SMI 進(jìn)而影響心肌功能的主要原因[3]。左西孟旦（levosimendan，Levo）是一種鈣離子增敏劑，具有良好的正性肌力和擴(kuò)血管功能。此外，Levo 還顯示出其他重要的非正性肌力作用，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。臨床研究證實(shí)，Levo 可通過(guò)改善心力衰竭患者線粒體氧化平衡，達(dá)到心臟保護(hù)作用[4]。由此筆者提出假設(shè)，Levo 可能會(huì)通過(guò)影響SMI 小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Levo 對(duì)SMI 的作用機(jī)制，以期對(duì)其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及給藥 清潔級(jí)雄性C57 小鼠，體重25～30 g，由北京維通利華公司提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為Control 組、SMI 組、SMI+Levo 組，每組6 只。自由進(jìn)食和飲水1 周。SMI 組腹腔注射脂多糖（LPS）（10 mg/kg），SMI+Levo 組在給予LPS 后3 h 腹腔注射Levo（24 μg/kg），SMI 組在給予LPS 后3 h 腹腔注射同等劑量生理鹽水，Control 組在0、3 h 腹腔注射同等劑量生理鹽水。腹腔注射LPS 后，SMI 組與SMI+Levo 組小鼠均出現(xiàn)毛發(fā)豎立、精神萎靡等膿毒癥表現(xiàn)，而Control 組無(wú)上述表現(xiàn)。所有實(shí)驗(yàn)均在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，經(jīng)過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)授予的項(xiàng)目許可（2020002）。

1.2 心臟超聲測(cè)定 6 h 測(cè)定小鼠心臟功能，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，胸前區(qū)脫毛，使用VEVO2100 超聲設(shè)備（VisualSonics 公司）獲取經(jīng)胸二維M 型超聲心動(dòng)圖，反復(fù)測(cè)量3 次，選取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，測(cè)量計(jì)算得出左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）及心輸出量（cardiac output，CO）。

1.3 血及組織標(biāo)本的采集與處理 超聲測(cè)量完畢后摘眼球取血處死小鼠，留取的血標(biāo)本中加入抑肽酶20 μL、10%EDTA-Na 15 μL，4℃3 000 r/min，離心15 min，取上清液-80℃保存；快速留取小鼠心臟，生理鹽水沖洗干凈后放入4%甲醛固定液中保存，待HE 染色后于光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。留取部分左心室放入4%戊二醛固定，待電鏡觀察。

1.4 檢查指標(biāo)及方法

1.4.1 血漿肌鈣蛋白Ⅰ（cTnI）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）測(cè)定血漿中cTnⅠ、CK、TNF-α、IL-1β 水平，藥盒購(gòu)自北京欣博盛生物科技有限公司，具體操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察心臟組織形態(tài)學(xué)改變 心肌組織在4%多聚甲醛中室溫固定48 h，石蠟包埋，切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察（DM3000 LED，Wetzlar，德國(guó)）。根據(jù)Kishimoto 方法[5]對(duì)每組小鼠心肌病理變化進(jìn)行評(píng)分，即每張切片選取5 個(gè)高倍視野，從炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌變性壞死兩方面觀察病變情況，計(jì)算每個(gè)視野中炎性浸潤(rùn)和壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野的面積之比，無(wú)病變計(jì)0 分，＜25%計(jì)1 分，25%～50%計(jì)2 分，50%～75%計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分。

1.4.3 透射電子顯微鏡觀察心臟組織線粒體改變 取出經(jīng)4%戊二醛固定的心臟組織，經(jīng)脫水、包埋、切片及染色后，在電鏡下（HT7800/HT7700，東京，日本）觀察，采集不同倍數(shù)下心肌組織中線粒體形態(tài)及自噬小體圖像并留存。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)均以±s 表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差（ANOVA）分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心臟功能指標(biāo)變化 與Control 組相比，SMI 組小鼠心臟功能指標(biāo)LVEF、LVFS 及CO 均明顯降低（分別為65.96±8.16 vs.35.78±4.87，35.87±6.05 vs.16.80±2.58，18.19±2.84 vs.9.34±1.23，均P＜0.05）；與SMI 組相比，SMI+Levo 組LVEF、LVFS 及CO 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者均明顯升高（分別為35.78±4.87 vs.45.88±2.63，16.80±2.58 vs.24.01±3.4，9.34± 1.23 vs.14.80±3.41，均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 入組后6 h 各組小鼠LVEF、LVFS、CO 水平變化Fig 1 Changes in LVEF，LVFS，and CO levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.2 小鼠心肌損傷指標(biāo)變化 與Control 組相比，SMI 組小鼠心肌損傷指標(biāo)cTnI、CK 均明顯升高（1.25±0.36 vs.6.99±0.39，866.93±378.51 vs.5 427.22±875.23，均P＜0.05）；與SMI 組相比，SMI+Levo 組小鼠cTnI、CK 均明顯降低（分別為6.99±0.39 vs.6.24±0.46，5 427.22±875.23 vs.3 587.67±460.90，均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 入組后6 h 各組小鼠血漿cTnI、CK 水平變化Fig 2 Changes in plasma cTnI and CK levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.3 小鼠血漿炎癥因子水平變化 與Control 組相比，SMI 組小鼠的血漿TNF-α（μg/L）、IL-1β（μg/L）水平均顯著升高（58.33±10.98 vs.658.50±91.87，32.83±3.43 vs.114.83±5.98，均P＜0.01）；與SMI 組比較，SMI+Levo 組小鼠TNF-α、IL-1β 水平均明顯降低（658.50±91.87 vs.431.00±18.17，114.83±5.98 vs.74.70±26.13，均P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 入組后6 h 各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β 水平Fig 3 Plasma TNF-α and IL-1β levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.4 小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 Control 組小鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；SMI 組小鼠出現(xiàn)心肌纖維排列不規(guī)整，部分心肌纖維斷裂，橫紋模糊甚至消失，間質(zhì)出血水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；與SMI 組相比，SMI+Levo 組小鼠心肌損傷有所好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖4。與Control 組相比，SMI 組小鼠心肌組織病理評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；SMI +Levo 組與SMI 組相比，病理學(xué)評(píng)分雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。

圖5 入組后6 h 各組小鼠心肌病理變化評(píng)分Fig 5 Score of myocardial pathological changes of mice in each group 6 hours after grouping

2.5 小鼠心肌組織線粒體形態(tài)改變 Control 組小鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)規(guī)整；SMI 組小鼠心肌細(xì)胞線粒體排列紊亂、水腫、線粒體嵴減少，偶見(jiàn)空泡變性，排列不整齊，肌絲束分離，Z 線扭曲，間距縮短，自噬小體增多；SMI+Levo 組與SMI 組相比，心肌組織線粒體損傷有所好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖6。

圖6 入組后6 h 各組小鼠心肌組織線粒體形態(tài)改變Fig 6 Morphological changes of mitochondria in myocardial tissue of mice in each group 6 hours after grouping

3 討論

膿毒癥是臨床上最為常見(jiàn)的急危重癥，近年來(lái)其發(fā)病率逐年升高，已成為重癥患者死亡的主要原因。據(jù)研究調(diào)查顯示，每年約有膿毒癥患者3 000 萬(wàn)例，死亡人數(shù)高達(dá)600 多萬(wàn)[6]。SMI 是膿毒癥最嚴(yán)重和致命的并發(fā)癥之一。

SMI 的作用機(jī)制目前尚在研究當(dāng)中，據(jù)已有的研究證實(shí)，SMI 的作用機(jī)制包括：（1）促炎/抗炎反應(yīng)失調(diào)[7]。（2）細(xì)胞凋亡[8]。（3）氧化應(yīng)激[9]。（4）線粒體功能障礙[10]等。但確切機(jī)制尚未完全闡明。

研究表明，膿毒癥或膿毒癥休克患者可以發(fā)生左心室收縮功能障礙[11]。LVEF、LVFS 及CO 是反映心臟收縮功能較好的指標(biāo)。在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中，多種原因會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)毛細(xì)血管通透性改變，使血管容量減少[12]。SMI 時(shí)，心臟超聲顯示LVEF、LVFS及CO 顯著下降。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證明，SMI 組LVEF、LVFS 及CO 明顯低于Control 組，提示腹腔注射LPS后，膿毒癥小鼠存在左室收縮功能障礙。SMI+Levo 組與LPS 組相比，LVEF、LVFS 及CO 的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Levo 可顯著改善小鼠左室收縮功能。

cTnI、CK 是觀察心肌損傷的重要生物標(biāo)志物。cTnI 大部分以結(jié)合蛋白的形式固定在肌原纖維上，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損害時(shí)，游離狀態(tài)的cTnI 會(huì)首先進(jìn)入到細(xì)胞外液的血液循環(huán)中，濃度越高，反映心肌損傷越嚴(yán)重[13]。CK 主要存在于心肌細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中，參與細(xì)胞能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮及ATP 的再生[14]。近年來(lái)認(rèn)為心肌線粒體膜腫脹、通透性增加、線粒體釋放相關(guān)凋亡蛋白等是導(dǎo)致膿毒癥心力衰竭的主要機(jī)制[15]，因此在SMI 小鼠中cTnI、CK 的水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在腹腔注射LPS 6 h 后，SMI 組小鼠cTnI、CK 水平明顯升高，SMI+Levo 組相較于SMI 組，cTnI 與CK 水平明顯下降。由此可見(jiàn)，Levo 可減輕SMI 小鼠的心肌損傷，機(jī)制可能為L(zhǎng)evo 直接與cTnI 的氨基末端結(jié)合，增強(qiáng)cTnI 與鈣離子復(fù)合物的構(gòu)象穩(wěn)定性和維持線粒體的穩(wěn)定性[16-17]。

促炎/抗炎反應(yīng)失調(diào)在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了非常重要的作用。TNF-α 是首先被證實(shí)在膿毒癥炎癥瀑布中起重要作用的細(xì)胞因子[18]。TNF-α 與心肌細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響心肌收縮時(shí)鈣離子流動(dòng)，出現(xiàn)心肌收縮功能障礙。IL-1β 在膿毒癥感染模型中也常見(jiàn)升高，產(chǎn)生心肌抑制因子。此外，TNF-α與IL-1β 間存在正反饋，也可促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19]。本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，SMI 組小鼠血漿TNF-α、IL-1β 水平顯著升高，提示SMI 小鼠存在炎癥反應(yīng)失調(diào)。SMI+Levo 組與SMI 組相比，血漿TNF-α、IL-1β水平顯著下降，證實(shí)Levo 有抗炎作用，可能通過(guò)抑制SMI 小鼠炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而減輕心肌損傷。從心肌組織形態(tài)學(xué)來(lái)看，SMI 組小鼠出現(xiàn)心肌纖維排列不規(guī)整，部分心肌纖維斷裂，橫紋模糊甚至消失，間質(zhì)出血水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。SMI+Levo 組小鼠心肌組織病理評(píng)分有好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，但無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與樣本量較小有關(guān)。

膿毒癥還可以引起線粒體損傷與功能障礙[20]。膿毒癥會(huì)導(dǎo)致體液大量丟失，組織嚴(yán)重缺氧，刺激體內(nèi)一氧化氮（NO）、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）過(guò)量生成，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激水平升高，ATP 生成減少[21]，線粒體能量代謝障礙，功能異常。此外，LPS 也可誘導(dǎo)NO 合酶生成，使NO 過(guò)量產(chǎn)生。膿毒癥患者外周血中的白細(xì)胞在抗炎過(guò)程中損傷線粒體內(nèi)膜，線粒體氧化應(yīng)激與內(nèi)膜損傷互為正反饋，加速線粒體損傷[22]。在TNF-α 等細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激的共同作用下，線粒體內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，大量鈣離子流入線粒體內(nèi)，形成“鈣超載”。鈣超載使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）呈高通透、持續(xù)開(kāi)放狀態(tài)，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)破壞[23]，加速線粒體氧化應(yīng)激和能量代謝障礙[24]。此外，膿毒癥導(dǎo)致線粒體損傷的機(jī)制還包括：（1）線粒體呼吸鏈及內(nèi)膜損傷[25]。（2）線粒體DNA 損傷與突變[26]。（3）線粒體解耦聯(lián)[27]。（4）線粒體分裂、融合及生物發(fā)生異常[28]。（5）線粒體自噬[29]等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn)：SMI 組小鼠線粒體排列紊亂，大量線粒體嵴減少、空泡變性，這是線粒體損傷的標(biāo)志。SMI+Levo 組線粒體損傷明顯減輕，證明Levo 可改善SMI 小鼠心肌細(xì)胞的線粒體損傷進(jìn)而達(dá)到保護(hù)心臟功能的目的。

綜上所述，SMI 的病理發(fā)展過(guò)程是損害心肌細(xì)胞與線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響心臟收縮功能。之前研究證實(shí)Levo 對(duì)心力衰竭患者的心功能有著明顯的保護(hù)作用[30]。本結(jié)果再次證實(shí)，Levo 可以有效改善SMI小鼠的心功能，可能與通過(guò)抑制炎癥減輕線粒體損傷有關(guān)。這將為改善SMI 患者治療方案，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量提供有效依據(jù)。但是，本實(shí)驗(yàn)仍具有一定局限性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能完全代替臨床，需要更多隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)或真實(shí)世界研究的證據(jù)支持。