不同保存條件對血清樣本細胞因子測定的影響

毛鐳篥,張麗,李薇,黃媛,王斐,吳衛(wèi)(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京100730)

細胞因子(cytokine)是由免疫細胞(如單核細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等)或某些非免疫細胞(內(nèi)皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質,能結合相應受體,調節(jié)細胞生長、分化,參與機體免疫應答和炎癥反應[1]。細胞因子分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等六大家族。大量研究表明細胞因子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關,已在國內(nèi)被納入眾多指南與共識中,如《感染相關生物標志物臨床意義解讀專家共識》、《中國急性胰腺炎診治指南》、《中國急診感染性休克臨床實踐指南》、《中國膿毒癥早期預防與阻斷急診專家共識》、《淋巴瘤相關噬血細胞綜合征診治中國專家共識》[2-6]。標本的采集方法、抗凝劑的選擇、貯存條件以及其他分析前處理均會影響細胞因子的準確測定[7],目前,尚無關于細胞因子檢測的標準化指南或共識。本研究主要觀察不同保存溫度及時間下血清標本中細胞因子,如白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的穩(wěn)定性,旨在探討血清樣本細胞因子準確測量的可靠條件。

1 資料與方法

1.1標本來源 隨機選取北京協(xié)和醫(yī)院2022年3月至10月就診的120例患者作為研究對象,其中男性58 例,女性62例,年齡22～88歲,平均年齡56歲。納入標準:(1)標本自采集至即刻上機測定,時長在1 h以內(nèi);(2)有低、中、高不同濃度范圍的標本。排除標準:乳糜血及溶血標本。

1.2儀器與試劑 IMMULITE1000全自動化學發(fā)光免疫分析儀及配套IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α檢測試劑、定標液和質控品(德國SIEMENS公司);3.5 mL規(guī)格含分離膠血清管(VACUTTE公司);1.5 mL規(guī)格EP管(XYGEN公司)。

1.3方法 120例研究對象靜脈血標本在1 500×g下離心10 min。離心后根據(jù)保存條件分為5組,包括:(1)室溫原管組40例,標本在室溫原管條件下保存,不分裝;(2)室溫分裝組20例,將血清分裝至EP管,在室溫條件下保存;(3)4 ℃原管組20例,樣本置于4 ℃條件下保存,不分裝; (4)4 ℃分裝組20例,將血清分裝至EP管,在4 ℃條件下保存;(5)-20 ℃組20例,將血清分裝至EP管,在-20 ℃條件下保存。第(1)組中的20例標本和(2)(3)(4)組分別測定即刻、6 h、24 h的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結果;第(1)組中的另外20例標本用于分析IL-8的穩(wěn)定性,分別測定即刻、2 h、3 h、4 h、5 h的IL-8結果;第(5)組-20 ℃組測定即刻及-20 ℃冷凍6月后的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結果。即刻是指樣本自采集、接收、離心至上機,整個時長控制在1 h左右,也是穩(wěn)定性研究的起始點。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行。 IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的檢測結果呈非正態(tài)分布,用M(P25,P75)描述,組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。根據(jù)SIEMENS廠家說明書, IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α參考區(qū)間上限分別為5.9 pg/mL、62 pg/mL、9.1 pg/mL、8.1 pg/mL,檢測范圍分別為2.0～1 000 pg/mL、2.0～7 500 pg/mL、1.0～1 000 pg/mL、1.7～1 000 pg/mL。穩(wěn)定性比對判斷標準:(1)廠家推薦的檢測結果相對偏差在±15%以內(nèi)。(2)根據(jù)CNAS-CL02《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明》,應有≥80%的結果符合要求?？傊?每組結果的相對偏差±15%的標本數(shù)需≥16個,且差異無統(tǒng)計學意義,表示比對通過。

2 結果

2.1室溫原管組IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結果 室溫原管組中IL-6、IL-10、TNF-α在6 h結果與即刻相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),比對通過率分別為80%、95%、80%,均≥80%; 24 h結果與即刻相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),比對通過率分別為70%、85%、80%,IL-6在24 h的穩(wěn)定性比對不通過。IL-8在6 h、24 h的檢測結果與即刻相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 6 h和24 h比對通過率僅為5%、0,結果見表1。

表1 室溫原管組中細胞因子在各時間點結果的比較

在即刻結果中,IL-8有5例陽性樣本,陽性率為25%; 6 h有17例陽性標本,陽性率為85%,假陽性率為60%,升高倍數(shù)最高可達28.8倍;24 h有19例陽性樣本,陽性率為95%,假陽性率為70%,升高的倍數(shù)最高可達496.8倍。隨放置時間延長,IL-8明顯升高,假陽性率也不斷增加,結果見表2和圖1。將IL-8在6 h、24 h升高的倍數(shù)與單核細胞數(shù)進行Spearman相關性分析,結果r分別為0.313、0.365,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而IL-6、IL-10、TNF-α在6 h、24 h的陽性率與即刻結果一致,陽性率并未增加。

圖1 IL-8在6 h和24 h檢測值與即刻相比變化的倍數(shù)

表2 室溫原管組中IL-8在各時間點結果的比較

2.2室溫原管中 IL-8穩(wěn)定性分析 20例血清樣本在室溫放置2 h、3 h、4 h、5 h后,其IL-8結果與即刻相比,P值分別為0.820、0.461、0.076、0.003,僅放置5 h的結果與即刻相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。比對通過率分別為80%、35%、15%、10%;僅2 h的比對通過。室溫原管組中IL-8在即刻、2 h、3 h、4 h、5 h的結果,其陽性率分別為15%、20%、25%、35%、45%,隨放置時間延長,其陽性率也在不斷增加,結果見表3。

2.3室溫分裝組結果 室溫分裝組中,IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測結果與即刻相比,比對通過率分別為95%、65%、100%、90%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);24 h的檢測結果與即刻相比,比對通過率分別為90%、50%、95%、95%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IL-8在6 h、24 h的比對通過率均<80%,比對不通過,結果見表4。

表4 室溫分裝組中細胞因子在各時間點結果的比較(pg/mL)

2.44 ℃原管組結果 4 ℃原管組中,IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測結果與即刻相比,比對通過率分別為85%、90%、90%、90%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24 h的檢測結果與即刻相比,比對通過率分別為80%、55%、90%、95%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IL-8放置24 h后比對不通過,其余各組比對通過率均≥80%。結果見表5。

表5 4 ℃原管組中細胞因子在各時間點結果的比較(pg/mL)

2.54 ℃分裝組結果 4 ℃組中, IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測結果與即刻相比,比對通過率分別為90%、100%、95%、95%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24 h結果與即刻相比,比對通過率分別為85%、95%、100%、85%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各結果比對通過率均≥80%,見表6。

表6 4 ℃分裝組中細胞因子在各時間點結果的比較

2.6-20 ℃分裝組結果 -20 ℃分裝組中, IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α放置6個月后其結果與即刻相比,P>0.05,差異無統(tǒng)計學意義,比對通過率均≥80%。結果見表7。

表7 -20 ℃分裝組中細胞因子在各時間點結果的比較

3 討論

細胞因子是免疫系統(tǒng)最活躍的分子標志,可以幫助臨床預測膿毒癥[8]、輔助診斷噬血細胞綜合征[9]、鑒別革蘭氏陰陽性細菌感染譜[10]以及早期診斷原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性淋巴瘤[11-12]等疾病。另外細胞因子可作為新冠肺炎的風向標,特別是IL-6是引發(fā)新冠肺炎細胞因子風暴的關鍵因子,是引起急性呼吸窘迫綜合和多臟器衰竭的重要原因[13]。早在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》提到:“重型、危重癥患者常有炎癥因子升高”,建議有條件的進行細胞因子的檢測[14]。延續(xù)至最新的《新型冠狀病毒感染診療方案(第十版)》中建議對于重型、危重型且實驗室檢測IL-6水平升高者可使用IL-6抑制劑[15]。

細胞因子檢測的標本類型多樣,包括血清、血漿、腦脊液、尿液、肺泡灌洗液、胸腹水、腹透液等,如何對不同類型的標本進行規(guī)范標準化的前處理,以保證檢測結果的穩(wěn)定性和準確性,非常值得摸索及探討[7]。鑒于尚未出現(xiàn)標準化的分析規(guī)程,本實驗分析了不同溫度不同保存時間對血清管IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α測定結果的影響。

IL-8作為促炎因子,由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞分泌,可吸引中性粒細胞,而中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放又能誘導氣道上皮細胞IL-8基因的表達,形成惡性循環(huán),在慢性阻塞性肺炎及哮喘中有重要的臨床意義[16]。在本實驗中,IL-8在原管室溫條件下放置時,其假陽性率會隨時間的延長而增加,放置6 h和24 h時,假陽性率分別為45%、55%,與既往文獻相似[7],可能因為采用血清管時,血液凝固過程中的凝血酶誘導了Rho/JNK級聯(lián)(Rho是凝血酶信號通路的關鍵中介,JNK的激活依賴于Rho的刺激),這種級聯(lián)可導致IL-8的轉錄和激活,刺激單核細胞表達IL-8[17],亦有研究表明,單核細胞要產(chǎn)生和釋放更高水平的IL-8,需要血小板的增強作用[18],因此單核細胞的數(shù)量并非是導致IL-8升高的唯一因素。本實驗中IL-8隨時間延長而升高的倍數(shù)雖然與單核細胞的數(shù)量無關,但在肺泡灌洗液中IL-8的升高與肺泡中的單核-巨噬細胞的數(shù)量有關,可能與單核細胞不同成熟階段有關[7]。需要注意的是,雖然使用了含分離膠的血清管,但顯然并不能阻止單核細胞持續(xù)分泌IL-8至血清中。在IL-8的穩(wěn)定性分析實驗中,雖然室溫放置2 h、3 h、4 h的結果與即刻相比差異無統(tǒng)計學意義,但3 h和4 h的穩(wěn)定性比對通過率<80%,不能滿足實驗室質量要求,而2 h的比對通過率為80%,結合實驗室實際日常工作,IL-8室溫放置2 h是可接受的,這點在廠家說明書中也有體現(xiàn)。IL-6、IL-10、TNF-α在本實驗中的分析結果較穩(wěn)定,因此若聯(lián)合檢測多項細胞因子時,由于IL-8的不穩(wěn)定性,室溫條件下建議2 h內(nèi)上機測定。關于24 h內(nèi)的穩(wěn)定性,只有4 ℃分裝組的所有CK結果的比對通過率均≥80%,故建議2～24 h可采取4 ℃分裝保存。在-20 ℃分裝時,CK保存6個月復融檢測時,結果依舊穩(wěn)定,本實驗IL-8在-20 ℃分裝凍存后,中位數(shù)結果從26.1 pg/mL升高為36.2 pg/mL,可能與在室溫復融時間過長有關。因此建議復融后及時檢測。有文獻報道[19], IL-6、IL-10、TNF-α在-20 ℃反復凍融結果穩(wěn)定,但IL-8在-20 ℃有限次凍融穩(wěn)定,建議避免多次凍融。本實驗雖未分析延遲離心對細胞因子的影響,但研究證實血清樣本在室溫放置24 h后再離心檢測,IL-6及IL-8明顯增高,因此有必要減少離心前時間[20]。

采用血清樣本聯(lián)合檢測多項細胞因子IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α時,標本自采集至上機,時間控制在2 h內(nèi),可采取室溫原管放置;2～24 h內(nèi)推薦4 ℃分裝;-20 ℃時6個月內(nèi)細胞因子結果穩(wěn)定可靠。日常工作中,采用血清樣本測定細胞因子時,如果不能滿足2 h內(nèi)及時上機,為避免IL-8的假陽性,建議分裝凍存。各實驗室可根據(jù)實際情況選擇不同保存方式。