外泌體在糖尿病視網(wǎng)膜病變的機制研究進展

王 勤,曾 鳳,盧亞梅,莊 菁,余克明,陳 熹,周元清,劉桂池

外泌體是廣泛存在于人體,由機體細胞產(chǎn)生并分泌的納米級細胞外囊泡,能相對穩(wěn)定地存在于各種生物組織和體液中,并攜帶特定的miRNA、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等多種信息分子,參與調(diào)控體內(nèi)多種疾病的病理生理過程。近年來隨著外泌體在各學(xué)科研究的不斷深入,其在眼科學(xué)領(lǐng)域的研究也迅速開展,目前發(fā)現(xiàn)外泌體在糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、自身免疫性葡萄膜炎、角膜病及青光眼等多種疾病中發(fā)揮重要作用。隨著生活水平的提高,全世界糖尿病視網(wǎng)膜病變致盲人數(shù)逐年增加,而糖尿病視網(wǎng)膜病變機制研究未明,近年許多研究發(fā)現(xiàn)外泌體在其中發(fā)揮著重要作用,本文對外泌體在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展機制的最新研究進展進行綜述。

?KEYWORDS：exosome; diabetic retinopathy; eye disease

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)主要由于長期高血糖狀態(tài)導(dǎo)致視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙,通過促炎因子、趨化因子等多種炎癥介質(zhì),導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)血管損傷、黃斑水腫等病理改變[1],而視網(wǎng)膜局部缺血缺氧,可發(fā)展成增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR),引發(fā)新生血管形成[2],最終發(fā)展為牽拉性視網(wǎng)膜脫離,造成不可逆的視力損害。目前,有關(guān)DR的病理機制尚不完全明確。近年來的研究表明DR可能與炎癥反應(yīng)、細胞因子如細胞內(nèi)黏附分子-1 (ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達、氧化應(yīng)激及PKC、AKT/ERK、MAPK等多種信號傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān),外泌體可能參與其中的一些重要環(huán)節(jié)[3]。近年來,外泌體在腫瘤、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)中取得了顯著研究成果,使外泌體的研究逐漸成為針對多種疾病的前沿?zé)狳c研究,以下就外泌體來源、生物學(xué)功能及近年來發(fā)現(xiàn)的不同來源的外泌體如何參于DR的生理或病理過程,以及外泌體作為潛在治療靶點,在DR保護方面的研究進展進行闡述。

1 外泌體來源和功能及提取方法

1.1外泌體的來源1987年Johnstone 等[4]在對綿羊網(wǎng)織紅細胞進行離心時獲得了具有活性的囊泡,并首次將其命名為外泌體。隨著對外泌體的不斷研究,發(fā)現(xiàn)外泌體是由細胞產(chǎn)生并分泌的細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)。外泌體可有多種細胞來源,幾乎所有的細胞均可分泌,目前研究表明間充質(zhì)干細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞均有外泌體分泌功能[5]。大多數(shù)外泌體直徑約30～150nm,可攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂類及多種代謝產(chǎn)物。由于其獨特的脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu),使其能廣泛存在于血漿、唾液、房水、淋巴液、玻璃體液等各種體液中。

1.2外泌體的形成過程外泌體由細胞內(nèi)吞、出芽作用而形成,首先形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles, ILVs),進一步加工修飾轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗯蒹w(multivesicular bodies, MVBs)。當MVBs通過多種機制最終與細胞膜相融時,ILVs從細胞內(nèi)被釋放,形成外泌體[6]。MVBs可通過轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復(fù)合物(the endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)依賴途徑和ESCRT非依賴途徑兩種不同的途徑形成,具體過程可分為起始、內(nèi)吞、多泡體形成及分泌4個階段[7]。ESCRT途徑依靠ESCRT 0～Ⅲ、分選蛋白4(Vps4)和組成型熱休克蛋白Hsp-70等共同構(gòu)成的復(fù)合物發(fā)揮作用[8],主要通過對泛素化蛋白的進行分選,維持ILVs內(nèi)容物的特異性,但目前對ESCRT內(nèi)分子間如何協(xié)同作用并將特定的內(nèi)容物轉(zhuǎn)運至ILVs中的機制仍不明確[9]。ESCRT非依賴途徑在組裝形成MVBs時,主要由神經(jīng)酰胺對其內(nèi)容物進行篩選,促進特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及RNA進入ILVs,同時促進外泌體的釋放[10]。

1.3外泌體的生物學(xué)功能外泌體可攜帶多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸及代謝產(chǎn)物等多種生物信息分子,這使得外泌體具有多種功能。外泌體可通過釋放特定的蛋白質(zhì)而激活體內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)下游細胞的功能[11]。外泌體還可以攜帶活性信使RNA(mRNA)、miRNA,調(diào)節(jié)靶細胞的基因表達[12]。因此外泌體可參與機體的多種病理、生理過程,An等[13]研究表明外泌體參與機體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),具有促進新生血管形成,參與細胞增殖和分化調(diào)節(jié)等功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體在代謝、腫瘤、心血管及神經(jīng)退行性病變等多種疾病方面具有其獨特的診斷和治療價值[14]。

1.4外泌體的提取方法外泌體存在于多種體液,如血液、房水、唾液及相關(guān)培養(yǎng)基的上清液中,恰當?shù)奶崛》椒茏畲笙薅鹊谋ＷC外泌體提取的純度及質(zhì)量。目前有效地分離提取外泌體的方法包括超速離心、密度梯度離心、聚合物沉淀、超濾、免疫親和捕獲、尺寸排阻色譜法等,其中傳統(tǒng)的超速離心法是目前分離外泌體的金標準[15],超速離心法具有簡單易操作、低成本、適合大批量提取的特點。但在一定的離心力下,傳統(tǒng)的超速離心并不能將外泌體微泡和其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等分離[16],并可能對外泌體造成機械性損傷。密度梯度離心在一定程度上彌補了傳統(tǒng)超速離心純度低的缺點,但其產(chǎn)率相對較低。尺寸排阻法是根據(jù)不同囊泡的直徑大小不同,對其進行梯度洗脫,該方法最大特點是能保持外泌體的自然生物活性[17]。免疫親和捕獲法是依靠體內(nèi)的特異性抗原抗體反應(yīng)對外泌體表面的標志物進行捕獲分離的方法,該方法存在的主要問題是不能很好地保持外泌體的天然活性狀態(tài)[18]。因此,盡管有很多的方法能分離提取外泌體,但目前外泌體的制備仍然沒有標準化,根據(jù)不同的研究樣本及應(yīng)用環(huán)境,需要采取不同的提取方法,以保證實驗數(shù)據(jù)的準確性。

2 外泌體與DR

2.1血循環(huán)源性外泌體參與DR多種病理過程血循環(huán)源性外泌體可作為DR的新型生物標志物,相較于眼內(nèi)容物等生物標本,如玻璃體及房水等,血漿及血清等體液成分獲取更簡單、患者更容易接受、且獲取的標本量更大,使得外泌體的分離提取更簡便。Mazzeo等[19]通過微整列分析DR患者中miRNA的差異表達,并采用定量PCR法明確了miR-150-5p、miR-21-3p和miR-30b-5p的表達升高。進一步研究表明,miR-150-5p可調(diào)節(jié) VEGF表達[20],miR-30b-5p可介導(dǎo)間隙連接蛋白GJA1下調(diào)促進新生血管形成和內(nèi)皮細胞遷移[21]。因此攜帶miRNA的外泌體可以作為DR的潛在生物標志物。

與非糖尿病患者相比,糖尿病患者IFN-γ和TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)水平升高,表明炎癥與DR相關(guān)[22]。Huang等[23]研究表明糖尿病血漿外泌體可激活經(jīng)典的補體級聯(lián)反應(yīng),刺激機體趨化因子和促炎細胞因子上調(diào),造成血管損傷。S100A8是單核細胞和中性粒細胞分泌的促炎蛋白,于榮國等[24]研究發(fā)現(xiàn)DR患者的外泌體和玻璃體中S100A8表達明顯增高,可作為潛在的抗炎治療靶點。同時,高糖狀態(tài)可激活單核細胞,通過外泌體中的ICAM-1,進一步激活內(nèi)皮細胞,加重血管炎癥[25]。由此可見,外泌體通過參與運輸炎癥因子、激活內(nèi)皮細胞等,在DR中發(fā)揮重要作用。

PDR是指在視網(wǎng)膜缺血的基礎(chǔ)上引發(fā)新生血管形成,新生血管反復(fù)出血可造成玻璃體積血及牽拉性視網(wǎng)膜脫離[26],導(dǎo)致視力不可逆喪失。新生血管形成與多種細胞因子表達及信號通路的激活有關(guān),Tokarz等[27]對糖尿病患者細胞外囊泡中細胞因子及炎性因子水平進行分析,結(jié)果顯示血管內(nèi)皮生長因子可溶性受體2(VEGFR-2)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管抑制素、組織抑制劑等分泌明顯增加,這表明外泌體可作為信息傳遞者參與視網(wǎng)膜新生血管的形成。外泌體對新生血管的影響主要取決于外泌體中的成分,Li等[28]通過高通量測序及PCR檢測發(fā)現(xiàn)PDR患者血清外泌體中circRNA、miRNA及mRNA表達均存在差異,進一步研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體建立了一個circRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng),circRNA可通過miRNA反應(yīng)元件與miRNAs競爭性結(jié)合,抑制miRNA對其靶向mRNA的負性調(diào)控,稱為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA),而mRNA可通過PI3K-Akt、MAPK、Wnt等信號通路對新生血管產(chǎn)生影響。 Liu等[29]在糖尿病小鼠周細胞中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA-cPWWP2A高表達,并通過增強miR-579及其靶基因(包括緊密連接蛋白、血管生成素1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1)表達,上調(diào)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖、成管能力,cPWWP2A或miR-579表達的干預(yù)可能成為治療DR新的思路。而Moisseiev 等[30]研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能有效抑制缺氧導(dǎo)致的視網(wǎng)膜新生血管形成,對視網(wǎng)膜其保護作用。

2.2視網(wǎng)膜色素上皮細胞源性外泌體與氧化應(yīng)激視網(wǎng)膜色素上皮細胞是介于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜間的單層上皮細胞,極易受到氧化應(yīng)激,尤其是活性氧(ROS)的影響。ROS是指含氧的反應(yīng)性活性化學(xué)物質(zhì),包括過氧化物和超氧化物等,當視網(wǎng)膜色素上皮細胞受到過量ROS刺激時,將會導(dǎo)致細胞發(fā)生特異性改變:包括視網(wǎng)膜局部炎癥、細胞自噬以及VEGF過度產(chǎn)生等,并釋放更多含有VEGFR2的外泌體[31],VEGFR2可進一步通過磷脂酶-Cγ-蛋白激酶-C途徑激活MAP激酶介導(dǎo)新生血管的遷移與形成[32]。張惟等[33]研究表明在氧化應(yīng)激條件下,人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)外泌體可上調(diào)VEGF-A表達,同時下調(diào)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt),VEGF-A是血管生成的主要調(diào)節(jié)劑,可與內(nèi)皮細胞囊泡結(jié)合,增加血管通透性,促進新生血管形成;Akt作為RPE細胞的保護因子,可誘導(dǎo)下游效應(yīng)子FKHR和GSK-3beta的磷酸化,其降低可導(dǎo)致細胞損傷。而抑制氧化應(yīng)激對RPE可起保護作用,Maisto 等[34]實驗顯示黑色素受體5激動劑PG-901可減少視網(wǎng)膜色素上皮ROS的產(chǎn)生及VEGF的釋放,提高高糖條件下視網(wǎng)膜色素上皮的存活率,并可減少新生血管的形成,抑制DR進展。

2.3 Müller細胞來源的外泌體與DR Müller細胞作為特化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,在維持血視網(wǎng)膜屏障和神經(jīng)元功能方面發(fā)揮重要的作用。Proia 等[35]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞可分泌含有成纖維細胞生長因子-2和血管內(nèi)皮生長因子的細胞外囊泡。Liu 等[36]探索了人Müller細胞來源的外泌體 miR-9-3p 的功能,發(fā)現(xiàn) miR-9-3p 可限制DR中的1-磷酸鞘氨醇(S1P1),而S1P1可抑制AKT/ERK信號通路對VEGF-A誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化的影響,S1P1的限制影響了VEGFR2的活性,促進新生血管形成。Inada等[37]研究表明在缺氧條件下,小膠質(zhì)細胞被激活,釋放促炎細胞因子如IL-1β,促進Müller細胞產(chǎn)生VEGF,導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)功能破壞。同時其他來源的外泌體亦可對Müller細胞產(chǎn)生影響,富含血小板血漿的外泌體可以刺激PI3K-Akt信號通路和Yes相關(guān)蛋白表達,改善視網(wǎng)膜纖連蛋白及結(jié)締組織生長因子的表達,促進Müller細胞增殖并增加其纖維化活性,進而對BRB的緊密性產(chǎn)生破壞作用,加重DR進展[38]。同時胰腺β細胞分泌的含miR-15a外泌體可以激活A(yù)kt3通路導(dǎo)致氧化應(yīng)激,造成Müller細胞凋亡[39]。

2.4外泌體對DR的保護作用外泌體相比于細胞性質(zhì)更加穩(wěn)定更易于貯存,外泌體獨特的穩(wěn)定性及脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)使通過外泌體給藥成為可能,近年來外泌體在各種疾病中的治療作用也得到深入研究。視網(wǎng)膜缺血是視力受損和喪失的主要原因,也是DR晚期的主要表現(xiàn)。Mathew等[40]通過模擬體外缺血條件和體內(nèi)視網(wǎng)膜缺血研究表明,間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可被視網(wǎng)膜R28細胞以劑量及飽和度依賴的方式內(nèi)吞,可通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)及減少神經(jīng)細胞的凋亡對視神經(jīng)起保護作用。而人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體miR-17-3p通過靶向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)改善DR小鼠的炎癥反應(yīng)和氧化損傷,并抑制視網(wǎng)膜細胞的凋亡[41]。Li 等[42]進一步動物實驗證明骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)的外泌體miR-486-3p可經(jīng)由Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB軸抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡,并促進Müller細胞增殖,對DR小鼠起保護作用。

3 總結(jié)

隨著外泌體的分離、純化及檢測技術(shù)不斷進步,使得大量各種細胞來源的外泌體被深入研究。外泌體在越來越多的疾病診斷及治療中有了突破性的進展,而其在眼部疾病,特別是DR中的研究也在不斷深入。血循環(huán)源性外泌體可作為DR的新型生物標志物在DR的早期診斷中起重要作用;同時,外泌體也可通過炎癥刺激、新生血管形成、氧化應(yīng)激等機制加速DR的發(fā)展,外泌體亦可對DR的發(fā)生、發(fā)展起保護作用。盡管目前已經(jīng)有大量的研究證實了DR的發(fā)生和發(fā)展中外泌體起至關(guān)重要的作用,但其潛在的機制目前仍不十分清楚,需要進一步的科學(xué)研究。