視網膜母細胞瘤化療耐藥的研究進展

俞依琳,葛盛芳,范佳燕

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是兒童最常見的眼內惡性腫瘤,化療是目前治療RB最常用的方法,包括靜脈化療、動脈化療和玻璃體腔化療。然而,RB的化療耐藥時有發(fā)生,是導致RB患者保眼治療失敗的主要原因。因此,探索RB化療耐藥的發(fā)生發(fā)展機制、尋找RB治療新策略及藥物聯(lián)合治療的新方法具有重要臨床意義。本文綜述了RB細胞可通過ATP結合盒式蛋白(ABC轉運蛋白)、非編碼RNA、表觀遺傳學修飾、自噬、上皮-間充質轉化、細胞外基質改變等多種途徑獲得化療耐藥性,并對其潛在的治療靶點或藥物進行總結,以期為RB化療耐藥性的進一步研究提供參考。

references for further research on chemotherapy resistance of RB.

?KEYWORDS：retinoblastoma; chemotherapy resistance; cancer therapy

0 引言

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是兒童最常見的眼內惡性腫瘤,約95%的病例發(fā)生在5歲之前,是兒童期致盲、致殘的主要眼部疾病[1-2]。RB的全球發(fā)病率約為1/18000～1/16000,相當于每年約有8 000例新發(fā)病例[2-3]。既往研究認為,RB起源于原始視網膜祖細胞或視錐前體細胞[4],通常由視網膜母細胞瘤基因(RB1)的雙等位突變引起,可分為遺傳型(約占40%)和非遺傳型(約占60%)。RB的主要臨床表現(xiàn)有白瞳癥、斜視、眼球突出、青光眼、前房積膿等,晚期可侵犯視神經,甚至發(fā)生顱腦和全身遠處轉移,危及生命。根據(jù)RB的國際分期(IIRC分期及TNM分期),同時考慮患者的基礎健康情況、累及眼數(shù)、年齡、腫瘤的大小和位置以及轉移擴散的可能性等方面,RB的治療方式可選擇動/靜脈化療、局灶治療、放療和/或眼球摘除術[5]。

化療是RB最主要的治療方法,包括全身靜脈化療、動脈化療和玻璃體腔注射化療。靜脈化療(IVC)是最傳統(tǒng)的化療方式,常用的方案為長春新堿(vincristin,VCR)、依托泊苷(etoposide,VP-16)和卡鉑(carboplatin,Carbo)聯(lián)合的VEC方案[6]。選擇性動脈化療(IAC)通過股動脈-頸內動脈-眼動脈將化療藥物直接灌注至眼內進行治療,常用的化療藥物主要為馬法蘭(melphalan)、卡鉑和拓撲替康[7]。相比IVC,IAC的眼內局部藥物濃度更高、對腫瘤的殺傷作用更強、且全身副作用小,顯著提高了RB患兒的保眼率[8]。另外,RB常伴有玻璃體腔腫瘤種植或播散,玻璃體腔注射化療作為保眼治療的輔助手段之一,對于處理視網膜下種植和視網膜瘤體復發(fā)有較好的治療效果[9]。目前,玻璃體腔注射化療的常用藥物主要包括卡鉑、馬法蘭、甲氨蝶呤等。

近十幾年來,RB的治療模式取得了重大進展,從單純IAC發(fā)展為IAC、IVC、玻璃體腔注射化療等多種化療方式[5],顯著提高了RB保眼治療的成功率。然而,隨著化療次數(shù)的不斷增加,RB對化療藥物的敏感性逐漸降低,進一步產生化療耐藥性,最終導致保眼治療的失敗。如RB一線化療藥物卡鉑通過干擾DNA修復[6,10]誘導細胞凋亡,長期接受卡鉑治療的患者可通過多重機制[11-12]獲得耐藥性,造成保眼治療失敗。研究發(fā)現(xiàn),RB的組織病理學特征與其耐藥性密切相關[13],Schouten-Van Meeteren等[13]發(fā)現(xiàn),未分化的RB細胞對卡鉑、多柔比星和異環(huán)磷酰胺更加敏感。然而,目前對于RB發(fā)生化療耐藥的機制仍不完全清楚。因此,解析RB藥物敏感性的調控機制,探索其關鍵靶點,對RB的保眼治療具有重要的臨床意義。

1 視網膜母細胞瘤耐藥發(fā)生機制

1.1 ABC轉運蛋白介導在腫瘤治療的過程中,獲得性多藥耐藥(MDR)時常發(fā)生,是造成腫瘤生長和轉移的主要原因之一,導致患者的總生存期短、預后差。目前研究認為,ATP結合盒式蛋白(ABC轉運蛋白)過表達誘導的藥物外排是發(fā)生MDR的最主要原因之一[14]。ABC轉運蛋白是一個龐大且普遍存在的轉運體超家族,從ABC-A到ABC-G可分為7個亞家族,其中與癌癥MDR相關的主要包括ABC-B中的ABCB1/P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、ABC-G中的ABCG2/乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)和ABC-C中的ABCCs/多藥耐藥相關蛋白(MRPs)[15]。既往研究發(fā)現(xiàn),ABC轉運蛋白與RB化療耐藥性的產生密切相關。在RB中,MRPs和p170蛋白的表達增加與其化療失敗相關,使用環(huán)孢素可抑制p170表達而改善化療效果[16]。在具有依托泊苷/卡鉑耐藥性的RB細胞系和組織中均檢測出ABCB1和ABCC3蛋白的表達升高[17]。Chan等[18]在多種耐藥的RB細胞系中檢測出P-gp的表達較化療敏感組顯著增加,表明RB中的P-gp水平可能是監(jiān)測藥物療效的潛在靶點。另外,Zhang等[19]通過單細胞RNA測序,發(fā)現(xiàn)卡鉑誘導的RB耐藥性與ABC轉運蛋白的轉錄組重編程相關;使用ABCB1抑制劑可提高RB對卡鉑的治療敏感性。FOXM1(Forkhead Box M1)是控制細胞增殖的關鍵基因之一,研究發(fā)現(xiàn),FOXM1可通過直接上調ABC轉運蛋白C79(ABCC4)的轉錄增強卡鉑耐藥細胞(Y-4CR)的耐藥性[11]。

1.2非編碼RNA調控非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一種特殊類型的RNA,盡管ncRNA缺乏翻譯成蛋白質的能力,但其對細胞的增殖、凋亡、代謝等多種生物過程具有重要的調控作用[20]。ncRNA通常包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、microRNA(miRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA),這些ncRNA也被證實與各種眼部疾病(如白內障、早發(fā)性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性、眼腫瘤等)的發(fā)生和進展相關[21]。既往研究發(fā)現(xiàn),在RB化療耐藥的發(fā)展進程中,ncRNA也發(fā)揮著重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn),miR-34a可通過調控MAGE-A/p53軸和Notch1的表達增強RB對化療的敏感性[22-23]。miR-222介導的VHL下調通過增加缺氧誘導因子1α(HIF1α)的表達促進RB化學耐藥性的產生[24]。lncRNA-LINC00152通過招募miR-1調節(jié)RB中的YAP613,增強其對卡鉑和阿霉素的耐藥性[25]。Wang等[26]發(fā)現(xiàn),lncRNA UCA1作為miR-206的內源性RNA與其他RNA競爭,上調c-MET和AXL表達,誘導RB產生卡鉑耐藥性。另外,He等[27]發(fā)現(xiàn),miR-184在化療抵抗的RB細胞系中下降最顯著,直接抑制SLC7A5表達,增強RB對化療藥物的敏感性。上述研究提示,調節(jié)細胞內ncRNA的表達可作為改善RB治療中化學耐藥性的潛在治療靶點。

1.3表觀遺傳學修飾表觀遺傳學修飾是指在不改變DNA序列的情況下,受環(huán)境或其他因素影響導致其基因表達發(fā)生可遺傳的改變,主要包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、RNA修飾等。越來越多的證據(jù)表明,異常的表觀遺傳調控有助于腫瘤抗性的產生。因此,靶向表觀遺傳調節(jié)因子是逆轉耐藥性的有效策略[28]。

泛素樣含PHD和環(huán)指域1(ubiquitin-like ring finger domains,UHRF1)是DNA甲基化和組蛋白修飾的重要表觀遺傳調控因子,也是癌細胞增殖和存活的關鍵調控因子,近年來在癌癥研究中頗受關注。He等[29]發(fā)現(xiàn),UHRF1也是調節(jié)RB藥物敏感性的關鍵因子,具體來說,下調UHRF1通過介導XRCC4的低表達增強細胞DNA損傷和凋亡,從而使RB細胞對依托泊苷和喜樹堿的敏感性增加。

DOT1L(DOT1 like histone lysine methyltransferase)是一種組蛋白H3K79甲基轉移酶,在激活和維持基因轉錄過程中起著重要作用[30]。最近,DOT1L已成為MLL基因重排型血液腫瘤的一個熱點治療靶點[31]。Mao等[32]發(fā)現(xiàn),在RB中,DOT1L通過靶向HMGA2或直接破壞DNA損傷修復反應,加速細胞凋亡,從而增強RB細胞對化療藥物的敏感性[32]。

煙酰胺N-甲基轉移酶(NRMT)是一種甲基化酶,在體內能使煙酰胺(NAM)甲基化,生成N1-甲基煙酰胺(MNAM),參與多種代謝途徑。研究表明,NRMT通過調控SAM/SAH比值,降低組蛋白的整體甲基化水平,改變細胞的表觀遺傳狀態(tài)[33],從而促進腫瘤進展。Li等[34]在順鉑耐藥的RB細胞系中發(fā)現(xiàn)NRMT的表達顯著升高,下調NRMT可通過調控CENPA/Myc/Bcl2信號軸提高RB細胞對順鉑的敏感性。

1.4自噬自噬(autophagy)是細胞的一種防御機制,通過溶酶體介導,消除受損的細胞器和蛋白質聚集物,促進細胞生存。自噬在腫瘤起始和發(fā)展的所有階段均有參與,在癌癥中起雙重作用,顯示出腫瘤抑制或致癌活性。最近研究顯示,自噬的激活與腫瘤細胞的耐藥性相關,可作為抵抗化療耐藥的潛在治療靶點[35-36]。在RB中,研究發(fā)現(xiàn)卡鉑耐藥的細胞具有更高的自噬活性,進而驅動RB對多種化療藥物(如依托泊苷和長春新堿)耐藥性的產生[37]。另外,CD24是一種高度糖基化的蛋白,通過錨定糖基磷脂酰肌醇與膜脂筏域相連,在多種腫瘤中與患者的不良預后相關[38],且與腫瘤化療耐藥的產生密切相關[39-40]。Sun等[41]發(fā)現(xiàn),在人RB組織及細胞系中,CD24的表達上調與其對長春新堿的耐藥性相關。具體來說,CD24可募集PTEN,通過調節(jié)PTEN/AKT/mTORC1途徑激活自噬,從而降低RB對長春新堿的敏感性[41]。然而,不受限制的自噬激活也可導致細胞死亡,稱為自噬依賴的細胞死亡?；诖?誘導自噬依賴的細胞死亡正在成為一些實體腫瘤的潛在治療策略[42-43]。Liu等[37]報道了一種通過誘導自噬依賴性的鐵死亡消除RB多重耐藥性的新策略,該研究使用4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate)誘導自噬依賴性鐵死亡,從而清除多藥耐藥的RB細胞[37]。

1.5上皮-間充質轉化上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指上皮細胞獲得間充質表型的細胞重編程過程,參與腫瘤侵襲、轉移瘤的形成和腫瘤治療耐藥性的產生[44]。EMT通過下調E-鈣黏蛋白和緊密連接黏附分子導致上皮表型丟失,使癌細胞轉變?yōu)榫哂星忠u特征的間充質表型,從而促進化療耐藥性的產生[44]。研究發(fā)現(xiàn),長期曝露于化療藥物的RB細胞可通過ZEB1/SNAI2介導的EMT獲得轉移樣表型,并且通過ABCB1(MDR1)和組織蛋白酶L(CTSL)介導的藥物外排進一步獲得化療耐藥性[45]。Suresh Babu等[45]通過miRNA微陣列檢測發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p在晚期RB中表達顯著降低,這與EMT及耐藥相關基因的改變相關;提高miR-181a-5p水平,可降低ZEB1和SNAI2水平,暫停EMT進程,從而提高RB對化療藥物的敏感性。

1.6細胞外基質改變細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是由細胞合成、分泌的生物大分子在細胞表面或細胞之間構成的復雜網絡結構。細胞外基質表達譜的改變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。研究顯示,在依托泊苷耐藥的RB中,ECM的表達譜發(fā)生顯著改變,如蛋白聚糖mRNA表達水平顯著降低;α1-層黏連蛋白、纖連蛋白以及膠原蛋白Ⅳ表達水平顯著降低[46]。

1.7其他機制

腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSCs)是腫瘤中的一小群具有無限增殖潛能的、能重建腫瘤的細胞[47]。最近研究表明,CSCs誘導的癌細胞干樣表型是癌癥復發(fā)、耐藥和轉移的主要因素[48]。研究發(fā)現(xiàn),在RB腫瘤干細胞中,過表達miR-3163可降低 ABCG2的表達,顯著改善RB對順鉑、卡鉑、長春新堿、多柔比星和依托泊苷的多藥耐藥性[49]。

細胞焦亡又稱細胞炎性壞死,是一種有別于細胞凋亡的溶解性和炎癥性程序性細胞死亡途徑[50]。目前認為,細胞焦亡是由細胞內部一類叫做Gasdermins(GSDMs)的蛋白家族所介導的程序性壞死。GSDMs家族共有6個成員,其中5個成員(GSDM-A/B/C/D/E)均可以導致細胞焦亡,但其激活機制各不相同。最新研究發(fā)現(xiàn),GSDM-E通過觸發(fā)細胞焦亡抑制多種腫瘤的進展,包括三陰性乳腺癌、結直腸腫瘤和黑色素瘤[51]。Li等[52]發(fā)現(xiàn),GSDM-E在RB組織和細胞系中的表達均顯著降低,上調 GSDM-E可通過增強細胞焦亡提高RB細胞對卡鉑的敏感性。

綜合應激反應(ISR)可促進細胞對來自腫瘤微環(huán)境壓力的適應[53]。其中,激活轉錄因子4(ATF4)是線粒體應激調控中的關鍵基因,屬于廣泛應激(如缺氧或營養(yǎng)不足)反應的一部分,其作為數(shù)百個基因活動的總開關,幫助細胞在各種壓力下生存。最近研究表明,許多類型的腫瘤進展依賴于ATF4相關的應激反應,通過參與抗氧化反應、自噬、氨基酸生物合成和轉運等多種途徑促進腫瘤進展[54-59]。另外,ATF4也與腫瘤化療耐藥性的產生相關,Gao等[60]發(fā)現(xiàn),YAP/TAZ和ATF4通過抑制鐵死亡使HCC細胞獲得Sorafenib耐藥性。在RB中,研究發(fā)現(xiàn),低劑量給予核糖體蛋白L41(RPL41)肽[61]可通過降解ATF4顯著提高RB細胞對卡鉑的敏感性[62]。

2 小結與展望

化療耐藥主要可分為單藥耐藥和多藥耐藥。在RB耐藥性的發(fā)展過程中,一般是以單藥耐藥起始,之后逐步進展成為多藥耐藥。根據(jù)既往的研究結論,RB細胞化療耐藥性的發(fā)生發(fā)展主要由ABC轉運蛋白過表達[63]、ncRNA調控、表觀遺傳學修飾、自噬、EMT、ECM改變等多種途徑介導(表1)。針對上述機制,使用相應的靶向藥物可提高RB化療的療效。然而,目前關于RB耐藥性機制的研究尚少,主要集中在對RB細胞系層面的體外實驗研究,較少涉及體內研究;同時,目前已發(fā)表的相關研究也大多集中在ncRNA調控方面,未找到與耐藥性相關的特異分子機制。因此,未來對于RB產生化療耐藥的機制仍需進一步探索,尋找RB化療耐藥性發(fā)展的潛在治療靶點。

表1 提高RB藥物敏感性的潛在治療靶點或藥物

我國晚期RB患者居多,化療是最主要的治療方法,根據(jù)不同給藥途徑分為IVC、IAC和玻璃體腔注射化療。RB化療的多數(shù)藥物都是傳統(tǒng)的DNA毒性或細胞毒性藥物,盡管這些傳統(tǒng)藥物在RB的早期治療以及保眼治療方面表現(xiàn)出一定的有效性,但藥物的耐藥也時有發(fā)生,造成化療療效顯著下降,成為保眼治療失敗的主要原因。另外,RB瘤體異質性強,目前主要的突變基因都是不可成藥靶點,導致RB靶向治療研究領域一直面臨著嚴峻挑戰(zhàn)。因此,探索RB化療耐藥的發(fā)生發(fā)展機制、尋找RB治療新策略及尋找藥物聯(lián)合治療的新方法具有重要臨床意義。