17β-雌二醇抗BALB/c與C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜光照損傷的比較

李紅波,劉鑫宇,鐘 華,姬佳彤,方佳妮,李炳武,尚雯婕,李曉楠

目的:通過建立BALB/c與C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型,研究17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用,為成功構(gòu)建E2抗視網(wǎng)膜光損傷模型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

方法:成年雌性BALB/c、C57BL/6小鼠各40～45只,實(shí)驗(yàn)分組如下:正常對(duì)照組,去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組,去勢(shì)光照組(小鼠去勢(shì)手術(shù)14d后進(jìn)行持續(xù)10000lx白光光照刺激4、8、12、16、24h組),玻璃體腔注射假手術(shù)組,生理鹽水組和E2預(yù)處理組(去勢(shì)手術(shù)14d后暗適應(yīng)24h后分別行玻璃體腔注射2μL生理鹽水或10-5mol/L E2),每組各6只。通過石蠟切片HE染色、TUNEL染色、視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)視網(wǎng)膜形態(tài)及功能變化。

結(jié)果:去勢(shì)光損組視網(wǎng)膜內(nèi)核層/外核層厚度從白光10000lx光照4h組開始顯著減小;玻璃體腔注射E2預(yù)處理可顯著抑制兩種品系小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的凋亡(P<0.01)以及C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)中最大混合反應(yīng)a波和b波波幅的下降(P<0.05)。

結(jié)論:相同光照條件對(duì)兩種品系小鼠光損敏感性存在差異;E2對(duì)BALB/c小鼠無論是視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)及功能學(xué)上都產(chǎn)生了保護(hù)作用,而對(duì)C57BL/6小鼠功能學(xué)保護(hù)作用顯著。

?KEYWORDS：retina light damage model; BALB/c mice; C57BL/6 mice; 17β-estradiol

0 引言

隨著電子產(chǎn)品使用頻率增加和照明設(shè)備的多樣化普及,長(zhǎng)時(shí)間光照射所引起的視網(wǎng)膜光損傷(light-induced retinal damage,LIRD)不斷發(fā)生。目前,LIRD具體的發(fā)病機(jī)制尚未系統(tǒng)闡述。研究表明,過量光照造成的光損傷可介導(dǎo)線粒體裂變導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量產(chǎn)生、小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及NLRP3炎性小體形成,造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變和視覺功能損傷[1]。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是臨床上常見的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病,大多數(shù)情況下表現(xiàn)為萎縮性ARMD,其特征主要為視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的緩慢變性;另外一部分表現(xiàn)為新生血管性ARMD,其特征是脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離和失明[2]。光損傷的病理過程與ARMD及視網(wǎng)膜色素變性等疾病存在較多相似之處,所以對(duì)LIRD作用及其機(jī)制的深入研究有著重要的臨床和理論價(jià)值?？紤]到臨床試驗(yàn)的限制性以及藥物誘導(dǎo)神經(jīng)退行性模型的不穩(wěn)定性,目前各類研究中常通過構(gòu)建大鼠LIRD模型用以研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機(jī)制和治療方法。不同品系大鼠的視網(wǎng)膜對(duì)光照損傷的敏感性不同。17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)是人體內(nèi)循環(huán)最豐富也是活性最強(qiáng)的雌激素,被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)劑。目前大量的相關(guān)研究均觀察到E2在視網(wǎng)膜中的神經(jīng)保護(hù)作用,但具體分子機(jī)制有待研究。本實(shí)驗(yàn)采用成年雌性去勢(shì)BALB/c與C57BL/6小鼠構(gòu)建LIRD模型,探究小鼠LIRD模型的構(gòu)建條件,比較兩種常見的具有代表性的品系小鼠視網(wǎng)膜對(duì)光照損傷的差異,為成功構(gòu)建小鼠LIRD模型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并在上述兩種小鼠品系光損動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過E2玻璃體腔注射預(yù)處理建立E2抗視網(wǎng)膜光照誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)損傷的保護(hù)模型,為后續(xù)深入開展E2抗視網(wǎng)膜光照誘導(dǎo)的OS損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料每批次實(shí)驗(yàn)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分組所需小鼠的數(shù)量選擇正常成年雌性8周齡BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各40～45只(購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。觀察所有小鼠體型適中,精神狀態(tài)良好,眼球正常無晶狀體混濁,排除角膜炎、白內(nèi)障等眼部疾病后將納入實(shí)驗(yàn)的各品系正常小鼠隨機(jī)分組,每組6只。BALB/c小鼠LIRD模型實(shí)驗(yàn)分組如下:正常組(normal control, NC),去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組(ovariectomized control, OC),去勢(shì)光損組(ovariectomized light, O-Light);根據(jù)光照時(shí)間分為:去勢(shì)光照4h組(O-light 4h),去勢(shì)光照8h組(O-light 8h),去勢(shì)光照12h組(O-light 12h),去勢(shì)光照16h組(O-light 16h)。C57BL/6小鼠LIRD模型實(shí)驗(yàn)分組如下:正常組,去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組,去勢(shì)光照4h組,去勢(shì)光照8h組,去勢(shì)光照12h組,去勢(shì)光照16h組,去勢(shì)光照24h組。E2預(yù)保護(hù)實(shí)驗(yàn)分組如下:正常組,去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組,去勢(shì)光損組:小鼠去勢(shì)手術(shù)14d后進(jìn)行持續(xù)10000lx白光光照刺激12h,假手術(shù)對(duì)照(ovariectomized lightdamaged-shamecontrol, OI-Shame)組:去勢(shì)手術(shù)14d后暗適應(yīng)24h后行玻璃體腔注射假手術(shù),生理鹽水組(ovariectomized lightdamaged-saline intravitreal injection, OI-Saline):去勢(shì)手術(shù)后暗適應(yīng)24h再行玻璃體腔注射2μL生理鹽水,E2預(yù)處理組(ovariectomized light damaged-E2 intravitreal injection, OI-E2):去勢(shì)手術(shù)后暗適應(yīng)24h再行玻璃體腔注射10-5mol/L E2 2μL。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動(dòng)物處理過程得到西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并符合公認(rèn)的研究動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)和視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)關(guān)于動(dòng)物使用的聲明。

1.2方法

1.2.1去勢(shì)手術(shù)去勢(shì)組小鼠異氟烷氣體麻醉后進(jìn)行摘除卵巢的去勢(shì)手術(shù)。小鼠背部髖關(guān)節(jié)連線上一指,于背部后正中線旁左右,備皮,充分暴露手術(shù)視野,在無菌條件下,向下做縱行切口約0.5～1cm,依次剪開皮膚,筋膜層,肌肉,找到卵巢后,在子宮末端與卵巢之間手術(shù)線結(jié)扎后將卵巢全部切除,縫合肌肉層和皮膚,消毒清理手術(shù)切口。術(shù)后將小鼠置于無菌墊料籠內(nèi),并在小鼠身下墊無菌棉紗布保溫,防止小鼠在麻醉中失溫死亡。在溫暖干凈通風(fēng)處待蘇醒。術(shù)后3d密切觀察皮膚切口及小鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食進(jìn)水情況,預(yù)防感染。待小鼠蘇醒能正?；顒?dòng)后轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)單元飼養(yǎng)2wk,充分代謝體內(nèi)殘余雌激素。

1.2.2建立光損模型本實(shí)驗(yàn)所采用的光損實(shí)驗(yàn)裝置為本實(shí)驗(yàn)小組依照嚴(yán)格的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研發(fā),并已獲批實(shí)用新型專利證書(ZL 2018 2 1068693. 8)。光照強(qiáng)度范圍為1000～10000lx。光源采用三基色LED燈,光線直接照射在裝置底部,可分為8檔對(duì)光照強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用10000lx照度。實(shí)驗(yàn)小鼠可在實(shí)驗(yàn)裝置動(dòng)物籠內(nèi)自由飲食、活動(dòng),通過實(shí)驗(yàn)裝置外部溫度調(diào)節(jié)及裝置內(nèi)部通風(fēng)設(shè)施以保持光照刺激期間裝置內(nèi)溫度維持在24℃。光照刺激實(shí)驗(yàn)前將小鼠放入暗室中暗適應(yīng)24h,以增強(qiáng)小鼠視網(wǎng)膜對(duì)光照刺激的敏感性,之后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同時(shí)間的光照刺激,光照刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即將小鼠放入暗室中暗恢復(fù)24h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè),比較不同光照持續(xù)時(shí)間條件下視網(wǎng)膜形態(tài)及功能的變化情況,選擇最佳的光損實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.3玻璃體腔給藥選擇正常成年雌性8周齡BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠,除對(duì)照組以外小鼠均行去勢(shì)手術(shù)后進(jìn)行玻璃體腔給藥。去勢(shì)實(shí)驗(yàn)小鼠在暗適應(yīng)24h后,腹腔注射氯胺酮(120mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)進(jìn)行深度麻醉。我們之前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)10-5mol/L E2可有效預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3],故按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行玻璃體腔注射2μL 10-5mol/L E2、2μL生理鹽水以及構(gòu)建假手術(shù)對(duì)照。具體操作方法如下:手術(shù)鑷分離小鼠眼瞼,固定并使眼球突出,眼球表皮滴加表面麻醉劑鹽酸奧布卡因滴眼液,以顳側(cè)虹膜邊緣外1～2mm為進(jìn)針點(diǎn),斜行45度進(jìn)針約2mm,進(jìn)針后有明顯落空感,觀察并確定微量注射器針尖進(jìn)入玻璃體腔后注射。玻璃體腔給藥在暗室中紅光照射下進(jìn)行,以保持暗適應(yīng)。

1.2.4視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)小鼠光照刺激結(jié)束后,暗恢復(fù)24h后立即進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)檢測(cè),根據(jù)小鼠體質(zhì)量腹腔注射戊巴比妥鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)與速眠新Ⅱ注射液(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所試制)進(jìn)行深度麻醉與肌松。待小鼠麻醉后在小鼠眼球表面滴加復(fù)方托吡卡胺滴眼液,作用5min以充分?jǐn)U瞳,滴加表面麻醉劑鹽酸奧布卡因,以便檢測(cè)操作。將小鼠放于檢測(cè)臺(tái)上,檢測(cè)一側(cè)的眼球充分暴露正對(duì)光源,另一側(cè)貼黑色膠布,避免光源影響,放置角膜電極,尾電極和頰電極,待波形穩(wěn)定后依次進(jìn)行ERG五項(xiàng)基本反應(yīng)檢測(cè),檢測(cè)完畢后檢測(cè)對(duì)側(cè)眼球。整個(gè)過程均在暗室中進(jìn)行,采用儀器為RETI-scan系統(tǒng)(Roland Consult)。

1.2.5制作石蠟切片完成ERG檢測(cè)后將小鼠正常飼養(yǎng)7d,心內(nèi)注射大劑量麻醉劑處死小鼠,摘取左眼眼球制作標(biāo)本。每個(gè)眼球在角膜12∶00方向,距角鞏膜緣約1mm處使用紋身液做標(biāo)記,采用對(duì)軟組織破壞小的固定液(冰醋酸∶生理鹽水∶40%甲醛∶75%乙醇=1∶2∶7∶10)固定眼球,常規(guī)脫水、透明、包埋,將事先標(biāo)記好視神經(jīng)乳頭的蠟塊修切整齊,將蠟塊按正確方向放置于石蠟切片機(jī)上,從視神經(jīng)乳頭鼻側(cè)區(qū)開始切片,設(shè)置切片厚度為10μm,隨時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察切片進(jìn)展情況,待蠟塊切面接近視神經(jīng)乳頭處時(shí),調(diào)整切片厚度為4μm,顯微鏡下觀察切割過視神經(jīng)乳頭進(jìn)入顳側(cè)區(qū)開始,連續(xù)切取石蠟切片15張。

1.2.6 HE染色取5張組織切片充分干燥后進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察比較視網(wǎng)膜乳頭部附近各層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化,對(duì)距乳頭部不同距離處(每次間隔5μm)的內(nèi)外核層厚度進(jìn)行測(cè)量,取5張切片的平均值,累計(jì)6個(gè)獨(dú)立重復(fù)樣本后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 TUNEL檢測(cè)眼球石蠟切片于烘箱干烤脫蠟后,按照TUNEL染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)流程說明進(jìn)行染色,顯微鏡下選擇距視神經(jīng)乳頭相同距離的視網(wǎng)膜部位,觀察比較光損傷后不同品系大鼠視網(wǎng)膜陽性染色細(xì)胞分布情況,并分別統(tǒng)計(jì)比較陽性染色細(xì)胞數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用GraphPad Prism 7.0a軟件程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間差異檢驗(yàn)采用ANOVA分析,結(jié)合Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行兩組分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正常組BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)比較正常組C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)與外核層(outer nuclear layer, ONL)厚度均顯著小于BALB/c,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。說明正常生理?xiàng)l件下,C57BL/6與BALB/c小鼠視網(wǎng)膜INL與ONL厚度自身存在顯著差異。

圖1 正常組BALB/c與C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜HE染色和視網(wǎng)膜厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖 A:BALB/c小鼠;B:C57BL/6小鼠;C:ONL厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖;D:INL厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖。

2.2不同光照時(shí)間下BALB/c小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化

10 000lx白光照射刺激4～16h的BALB/c小鼠各組視網(wǎng)膜INL、ONL厚度均較正常對(duì)照組顯著減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。說明從10000lx白光照射刺激4h開始,即可造成BALB/c小鼠視網(wǎng)膜組織損傷,特別是光損12h以后視網(wǎng)膜損傷尤為嚴(yán)重,ONL細(xì)胞幾乎完全消失,INL界限顯著縮小,ONL的損傷較INL更為敏感。

2.3不同光照時(shí)間下C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化

與正常對(duì)照組相比,去勢(shì)光照各組中10000lx白光照射刺激4～24h ONL厚度變化并不顯著,但I(xiàn)NL厚度顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3。說明在相同的光照損傷刺激條件下,C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜INL由于富含三類重要的神經(jīng)元,即視錐視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,所以對(duì)光損條件較ONL更為敏感。

2.4 E2玻璃體腔注射預(yù)處理下光損BALB/c小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化與去勢(shì)光照12h組相比,E2預(yù)處理組小鼠視網(wǎng)膜INL、ONL厚度顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4,進(jìn)而說明E2預(yù)處理可顯著抑制光損導(dǎo)致的BALB/c小鼠視網(wǎng)膜ONL及INL厚度的減小。

圖4 玻璃體腔給藥預(yù)處理后光損BALB/c小鼠視網(wǎng)膜HE染色和視網(wǎng)膜厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖 A:正常組;B:去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組;C:去勢(shì)光照12h組;D:假手術(shù)對(duì)照組;E:生理鹽水組;F:E2預(yù)處理組;G:ONL厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖;H:INL厚度蛛網(wǎng)統(tǒng)計(jì)圖。

2.5 E2玻璃體腔注射預(yù)處理下光損C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化與正常組相比去勢(shì)光照12h組C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜ONL、INL厚度顯著減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而E2預(yù)處理組與去勢(shì)光照12h組相比可增加ONL及INL厚度但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,形態(tài)學(xué)上E2抗C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞光損的作用表現(xiàn)并不顯著。

2.6 E2玻璃體腔注射預(yù)處理下光損BALB/c小鼠視網(wǎng)膜功能學(xué)變化與去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組相比,光損12h后BALB/c小鼠內(nèi)外層顯著出現(xiàn)凋亡陽性染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與去勢(shì)光照12h組相比,E2預(yù)處理組陽性細(xì)胞凋亡百分比顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。說明E2可顯著抑制由光損導(dǎo)致的BALB/c小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。

2.7 E2玻璃體腔注射預(yù)處理下光損C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜功能學(xué)變化與去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組相比,光損12h后BALB/c小鼠內(nèi)外層出現(xiàn)凋亡陽性染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與去勢(shì)光照12h組相比,E2預(yù)處理組陽性細(xì)胞凋亡百分比顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖7。說明E2可顯著抑制由光損導(dǎo)致的C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。

圖7 不同玻璃體腔給藥預(yù)處理后光損C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色 A:正常組;B:去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組;C:去勢(shì)光照12h組;D:假手術(shù)對(duì)照組;E:生理鹽水組;F:E2預(yù)處理組;G:視網(wǎng)膜凋亡陽性細(xì)胞染色統(tǒng)計(jì)圖。bP<0.01 vs 去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組;dP<0.01 vs 去勢(shì)光照12h組。

2.8 E2玻璃體腔注射預(yù)處理下光損C57BL/6小鼠的功能保護(hù)作用在10000lx光照12h后對(duì)正常C57BL/6小鼠并不會(huì)產(chǎn)生顯著作用,對(duì)去勢(shì)光損小鼠均使得最大混合反應(yīng)a波波譜及b波波幅顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖8。

圖8 玻璃體腔給藥預(yù)處理后光損C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜ERG檢測(cè) A:成年雌性去勢(shì)C57BL/6小鼠玻璃體腔給藥預(yù)處理后光損下視網(wǎng)膜ERG檢測(cè)圖;B:ERG檢測(cè)中最大混合反應(yīng)a波振幅統(tǒng)計(jì)圖;C:ERG檢測(cè)中最大混合反應(yīng)b波振幅統(tǒng)計(jì)圖。bP<0.01 vs 去勢(shì)手術(shù)對(duì)照組;cP<0.05,dP<0.01vs去勢(shì)光照12h組。

3 討論

不同光源以及光照強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間對(duì)光損動(dòng)物模型建立產(chǎn)生著重要影響。頻率高、能量大的藍(lán)光是光損模型構(gòu)建的良好選擇。研究表明,藍(lán)色LED光源構(gòu)建光損傷效率明顯優(yōu)于正常白光,而且藍(lán)光可誘導(dǎo)視錐感光細(xì)胞凋亡,并改變視紫紅質(zhì)定位[4]。同時(shí)過度暴露于藍(lán)光下可通過增加細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激平衡的破壞以及脂質(zhì)氧化物的沉積,進(jìn)而造成細(xì)胞鐵死亡發(fā)生[5]。白光可反應(yīng)多種混合光的綜合作用以及具有模擬日光對(duì)視網(wǎng)膜損傷的特點(diǎn),被大部分學(xué)者采用。在光照強(qiáng)度以及時(shí)間的選擇上,大多數(shù)學(xué)者采用4000～5000lx,且短時(shí)間進(jìn)行強(qiáng)光照射可構(gòu)建急性光損模型。研究表明采用短暫強(qiáng)光條件造成的光損傷可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子上調(diào),促進(jìn)CNV生長(zhǎng)進(jìn)而促進(jìn)進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性的發(fā)展,這也表明急性光損傷模型可能將專門用作新生血管性ARMD的模型[6]。基于上述因素,我們的實(shí)驗(yàn)采用10000lx白光并發(fā)現(xiàn)照射12h及以上能構(gòu)建相對(duì)穩(wěn)定的LIRD模型。

基于哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源廣泛的便捷性,目前動(dòng)物模型構(gòu)建主要以大鼠、小鼠為主。大鼠視網(wǎng)膜的背中央?yún)^(qū)被認(rèn)為與人類視網(wǎng)膜黃斑區(qū)功能類似,與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜病存在密切聯(lián)系。SD大鼠光損傷的敏感性最強(qiáng),在構(gòu)建LIRD模型被廣泛應(yīng)用。小鼠在光損模型應(yīng)用上主要包括BALB/c、C57BL/6以及其他特異性基因敲除小鼠。我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB/c、C57BL/6小鼠同時(shí)進(jìn)行LIRD模型構(gòu)建,分別觀察兩種不同品系小鼠在不同光照強(qiáng)度下視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的變化。C57BL/6小鼠為非白化鼠,視網(wǎng)膜存在RPE細(xì)胞。C57BL/6小鼠可表達(dá)RPE65(450Met)的耐光變體,對(duì)光誘導(dǎo)損傷具有一定的抵抗能力,更接近人類對(duì)光損的敏感性。研究表明RPE細(xì)胞既可以向光感受器運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如ω-3脂肪酸、葡萄糖和視黃醇,也可將特定離子、水和代謝終產(chǎn)物從視網(wǎng)膜下間隙輸送到脈絡(luò)膜血管,在維持視網(wǎng)膜正常代謝中起到了不可或缺的作用[7]。同時(shí)RPE細(xì)胞中含有大量的對(duì)光損傷敏感的物質(zhì)如線粒體和不飽和脂肪酸,過量光照可造成OS失衡并產(chǎn)生活性氧自由基導(dǎo)致感光細(xì)胞外段解體、內(nèi)節(jié)線粒體腫脹變性,進(jìn)一步加快了RPE細(xì)胞的凋亡[8]。BALB/c小鼠為白化鼠,視網(wǎng)膜沒有RPE細(xì)胞,不能直觀地反應(yīng)光照對(duì)人視網(wǎng)膜的損害。此外,C57BL/6與BALB/c小鼠的光感受器損失率存在顯著差異,在整個(gè)成年期BALB/c小鼠中發(fā)生視桿細(xì)胞的丟失更多,C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)和功能在成年后期將保持穩(wěn)定[9]。故我們的實(shí)驗(yàn)選取抗光損能力更強(qiáng)、更接近人體正常眼球結(jié)構(gòu)的C57BL/6小鼠來構(gòu)建LIRD模型。

E2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種強(qiáng)抗氧化劑,已在各種神經(jīng)元細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型中顯示出對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用,包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病[10]。E2通過增強(qiáng)大腦中調(diào)節(jié)認(rèn)知功能的不同區(qū)域的棘突生成來改善嚙齒動(dòng)物的海馬形態(tài)、可塑性和記憶功能[11],這可能會(huì)成為干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)AD中神經(jīng)變性的途徑之一。視網(wǎng)膜富含神經(jīng)元,可作為神經(jīng)系統(tǒng)的外延器官之一來研究E2的神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明,E2可以顯著抑制光誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞損傷,也可通過抑制toll樣受體2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞免受OS破壞[12]。OS是許多視網(wǎng)膜疾病的重要致病因素,在體光誘導(dǎo)損傷時(shí)OS在LIRD模型建立中起重要作用[13]。抗氧化劑的干預(yù)成為防止LIRD病情加重的重要措施之一。E2在視網(wǎng)膜細(xì)胞中可發(fā)揮顯著的抗氧化作用,通過減少ROS的產(chǎn)生來阻止OS誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元、RPE細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡,延緩視網(wǎng)膜變性的發(fā)生發(fā)展[14-15]。此外,研究表明E2預(yù)處理對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的RD和H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有顯著的保護(hù)作用,這種保護(hù)作用可能通過減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和增加自噬來實(shí)現(xiàn)[16]。這些發(fā)現(xiàn)表明E2及其結(jié)構(gòu)功能類似物具有良好的藥物研發(fā)前景進(jìn)而治療視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)白光照射可導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)嚴(yán)重破壞,2μL 10-5mol/L E2預(yù)處理可以顯著抑制BALB/c小鼠光感受器損害和ONL厚度減少以及抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡,同時(shí)在C57BL/6小鼠中形態(tài)學(xué)上E2并未表現(xiàn)出顯著的預(yù)保護(hù)作用,但可顯著抑制視網(wǎng)膜功能障礙,主要體現(xiàn)在顯著減少視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞的比例和顯著抑制最大混合反應(yīng)a、b波的下降。a波主要反映視網(wǎng)膜光感受器的功能,對(duì)視桿細(xì)胞較為敏感,而b波來自視網(wǎng)膜INL的電活動(dòng),與視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞有密切關(guān)系[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明E2對(duì)于抗光照誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜OS損傷具有重要的神經(jīng)細(xì)胞功能的保護(hù)作用。分析原因:(1)可能是因?yàn)锽ALB/c小鼠相對(duì)于C57BL/6小鼠在相同的光損條件刺激下,經(jīng)歷了更為劇烈的損傷,各組比較時(shí)E2保護(hù)作用的顯著性更容易突顯;(2)可能是由于品系的差異,E2對(duì)C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用在形態(tài)學(xué)改變相對(duì)于ERG等功能學(xué)改變更加滯后,光損7d后形態(tài)學(xué)上尚未累積到顯著變化。

綜上所述,不同品系小鼠對(duì)光損造成視網(wǎng)膜損傷的敏感性存在一定差異,通過相同條件下對(duì)兩種不同品系小鼠光損模型建立對(duì)比發(fā)現(xiàn),BALB/c小鼠ONL層對(duì)光損更敏感,而C57BL/6小鼠INL層對(duì)光損更敏感,采用C57BL/6小鼠品系造模更能模擬人正常眼球視網(wǎng)膜的光照損傷過程,對(duì)大多數(shù)光照損傷和視網(wǎng)膜病變更具有代表性。此外E2的玻璃體腔預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜功能的保護(hù)作用顯著,深入研究其保護(hù)作用機(jī)制將為臨床抗視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療藥物研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。