丁桂散臍部給藥的體內(nèi)藥動學(xué)研究

張永太，李佳璇，姜曉煒，馮年平

（上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，上海 201203）

臍，中醫(yī)穴位稱之“神闕”，與人體十二經(jīng)脈相連，與五臟六腑相通。臍部給藥屬中醫(yī)外治法，也可歸于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（Transdermal Drug Delivery System，TTS）范疇［1］。人體臍部皮膚表皮角質(zhì)層薄，屏障功能弱，皮下無脂肪組織，藥物易滲透彌散，有利于吸收；且皮下血管豐富，滲透力強(qiáng)吸收迅速，門靜脈、臍靜脈、腹壁靜脈與上下腔靜脈形成通道，利于敷臍藥物經(jīng)過該側(cè)支循環(huán)進(jìn)入血液而發(fā)揮作用［2］。臍部給藥可避免藥物的首過效應(yīng)，降低藥物毒性和不良反應(yīng)，維持穩(wěn)定而持久的血藥濃度，提高療效，減少給藥次數(shù)［3］。以丁香與肉桂為代表的溫里藥常用于臍部給藥，起到溫中散寒止痛的作用，如以丁香肉桂為主要藥物的市售成方制劑丁桂兒臍貼，在治療小兒腹痛腹瀉中療效卓著，受眾極廣。臍部給藥方式雖有悠久應(yīng)用歷史，且臨床療效確鑿，但目前對其現(xiàn)代機(jī)制的研究報道少見。

丁桂散由丁香、肉桂組成。方中的丁香具溫中降逆、補(bǔ)腎助陽的功效；肉桂具補(bǔ)火助陽、引火歸源、散寒止痛、活血通經(jīng)的功效［4-5］。丁桂散對多種炎性水腫有明顯的抑制作用，可明顯縮短豚鼠傷口愈合時間，提高溶菌酶的活性，促進(jìn)動物創(chuàng)面的白細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管、膠原纖維增生［5］。丁香中提取的丁香揮發(fā)油，其主要成分為丁香酚［6］。丁香酚有解熱、抗病原微生物、抗腫瘤、抗氧化作用［7-8］。肉桂中提取的揮發(fā)油，其主要成分為桂皮醛，體內(nèi)吸收后被代謝為肉桂酸，具有利膽、抗炎、抗真菌、抗突變、抗氧化、抑制血小板聚集等作用［7，9］。本文中，以丁香酚與肉桂酸為丁桂散中有效成分的代表作為檢測指標(biāo)，研究丁桂散臍部給藥的體內(nèi)藥動學(xué)特征。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 藥品與試劑

肉桂 （批號081107）、丁香 （批號080702）購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆蝗夤鹚幔兌龋?8%，批號MUST-10040201）、丁香酚（純度：98%，批號MUST-10040201）購于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購于默克股份兩合公司，其余試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠， （200±20）g/只，雌雄各半，SPF級，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。動物合格證號：SCXK（滬）2015003。動物于恒溫環(huán)境（24±2）℃飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后使用。

1.3 儀器

LC-2010A HT型高效液相色譜儀（日本島津公司），CP225D型、BSA224S型電子天平（德國Sartorius公司），Vortex genius 3 S25型圓周振蕩器（德國IKA公司），MiniSpin個人型高速離心機(jī)（德國Eppendorf AG公司），SB-3200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），TGL-16G-A型管式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠），DC-12H型氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 丁桂散的制備

將丁香與肉桂分別粉碎后過80目篩，再以各等份（w/w）混合均勻，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：30°C；流速：1.0 mL/mol。丁香酚檢測波長：280 nm；流動相：甲醇-水（60∶40）。肉桂酸檢測波長：270 nm；流動相：甲醇-乙腈-水-乙酸（25∶26∶49∶0.3）。

2.3 對照品溶液與質(zhì)控樣品的配制

精密稱取丁香酚與肉桂酸對照品適量，精密稱定，分別以甲醇配制成1.04 mg/mL（丁香酚）和20.20μg/mL（肉桂酸）的對照品母液，由此來配制系列濃度的對照品供試液。

分別以空白血漿配制丁香酚對照品濃度分別為0.37、2.95、5.91、23.64、94.55μg/mL，和肉桂酸對照品濃度分別為0.20、0.40、0.59、0.78、0.96、1.84μg/mL的血漿樣品，照2.4項下處理后檢測，擬合血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

質(zhì)控樣品的處理方法與血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品處理方法相同，丁香酚質(zhì)控樣品中丁香酚對照品低、中、高濃度分別為：2.95、23.64、94.55μg/mL；肉桂酸質(zhì)控樣品中肉桂酸對照品低、中、高濃度分別為0.40、0.96、1.84μg/mL。

2.4 血樣處理

取肝素抗凝血漿100μL于離心管中，精密加入1 mol/L的醋酸25μL，漩渦振蕩30 s，分別加入氯仿0.4 mL和0.3mL萃取2次，每次漩渦振蕩1 min，離心5 min（5 000 r/min），合并兩次氯仿提取液，氮?dú)獯蹈?，殘渣?0μL甲醇復(fù)溶，超聲5 min，漩渦1 min，離心10 min，即得樣品液。

2.5 體內(nèi)藥動學(xué)研究

參照國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》 （【H】GPT5-1）開展正常大鼠與潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）模型大鼠的臍部給藥藥代動力學(xué)研究。將SD大鼠隨機(jī)分成4組，分別為UC-臍部組、UC-旁開組、UC-灌胃組、正常-臍部組。其中UC組動物造模方式為：將大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，固定于鼠解剖臺上，將一直徑2.0 mm長約11 cm的橡膠輸液管，由肛門輕緩插入深約8 cm，給予5%的2，4，6-三硝基苯磺酸（0.2 mL/100 g），再注射50%的乙醇溶液0.3-0.5 mL，緩緩注入到大鼠腸腔內(nèi)，再注入少許空氣，提起大鼠尾部，倒置1-2 min，使造模劑充分滲入［10］。為模擬中醫(yī)寒癥UC成因，于第2天置冰水浴中2 min，1次/d，共3次。記錄大鼠每天的體重、進(jìn)食量、飲水量、毛發(fā)光澤度、大便性狀以及活動情況。臍部與旁開給藥組給藥前用5%水合氯醛麻醉，以電動剃須刀去除給藥部位鼠毛，分別于神闕穴（以臍部為中心）和旁開部位給予丁桂散細(xì)粉0.1 g（0.1 mL米醋調(diào)成糊狀）［11-12］，膠布固定，確保實(shí)驗(yàn)過程中膠布不脫落；灌胃組以1 mL溫水稀釋0.1 g丁桂散細(xì)粉，加入0.1 mL米醋，灌胃給藥。給藥后分別于0，10，30，60，120，180，240，360，480，720，1 440min從大鼠眼眶取血250μL，置于肝素化離心管中，離心5 min（離心力4 862×g，5 000 r/min）。所得血樣按2.4項下方法處理。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

丁香酚與肉桂酸的保留時間分別為13.00 min和9.80 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對色譜峰無明顯干擾（圖1），表明方法專屬性良好。

圖1 丁香酚與肉桂酸HPLC色譜圖

分別以丁香酚和肉桂酸峰面積X對各自在血漿中的質(zhì)量濃度Y進(jìn)行線性回歸，丁香酚與肉桂酸的回歸方程分別為Y＝29089X－5022.7（r＝0.999 9）和Y＝0.001X+94.62（r＝0.999 8），表明丁香酚與肉桂酸分別在濃度為0.37μg/mL-94.55μg/mL和0.20μg/mL-0.96μg/mL范圍內(nèi)，與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖2）。丁香酚與肉桂酸最低定量限分別為0.37 μg/mL和0.20μg/mL，其信噪比均高于10。

圖2 丁香酚（A）與肉桂酸（B）的濃度為因變量、峰面積為自變量的回歸曲線

丁香酚與肉桂酸低、中、高濃度的準(zhǔn)確度均在80%-120%之內(nèi)，精密度均不高于20% （表1）。將質(zhì)控樣品依照2.4項下操作后，在室溫下分別放置0、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣檢測，計算丁香酚與肉桂酸樣品的低、中、高濃度RSD分別為3.01、6.34、6.05，和7.13、7.55、7.90；將質(zhì)控樣品在－20℃存放，反復(fù)凍融3次，處理后測定濃度，得丁香酚與肉桂酸樣品的低、中、高濃度提取回收率 （%）分別為78.12±7.99、73.14±3.20、73.04±6.51，和84.95±9.01、81.86±4.78、104.71±4.08。以上結(jié)果符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”相關(guān)規(guī)定。

表1 丁香酚與肉桂酸質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度（n＝3）和精密度（日內(nèi)n＝6，日間n＝3）

表2 神闕穴、旁開、灌胃給藥后丁香酚體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù) （n＝5）

3.2 體內(nèi)藥動學(xué)結(jié)果

各給藥組血藥濃度自達(dá)峰后均呈緩慢下降趨勢，且有多峰現(xiàn)象，這可能由于散劑中藥物成分的溶出速率不規(guī)律所致。取樣終點(diǎn)的血藥濃度均在峰濃度的1/3以上，表明給藥24 h后，血中藥物仍維持較高濃度，這可能由于散劑中藥物溶出較慢，使吸收分布時間較長。灌胃給藥組吸收較為迅速，且血藥濃度維持在較高水平。UC模型組丁香酚血藥濃度高于正常組（圖3），但肉桂酸血藥濃度在各經(jīng)皮給藥組中變化趨勢相近（圖4）。

圖3 不同方式給予丁桂散后大鼠丁香酚血藥濃度-時間曲線（n＝5）

圖4 不同方式給予丁桂散后大鼠肉桂酸血藥濃度-時間曲線（n＝5）

以非房室模型對血藥濃度數(shù)值進(jìn)行分析，所得藥動學(xué)參數(shù)如表3和表4所示。與各經(jīng)皮給藥組相比，口服組吸收最快，兩種所測成分的Tmax最小。口服組兩種成分的Cmax最大，但與UC-臍部組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。另外口服組肉桂酸AUC0→t在各組中最大，顯著大于UC-臍部組（P＜0.05），丁香酚AUC0→t與UC-臍部組無顯著差異（P＞0.05）。UC-臍部組兩種成分的Tmax最大，但Cmax、AUC0→t與UC-旁開組相比無顯著差異（P＞0.05）。另外，UC-臍部組丁香酚的Cmax、AUC0→t均顯著高于正常-臍部組（P＜0.05），而該兩組的肉桂酸的以上參數(shù)間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表3 神闕穴、旁開、灌胃給藥后肉桂酸體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù) （n＝5）

4 討論

臍療作為中醫(yī)外治法為中醫(yī)臨床常用治療方法之一，具有取材容易、操作簡便、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)。神闕穴居臍中央，刺激此穴對五臟六腑具有調(diào)節(jié)作用。臍部給藥為中醫(yī)特色的給藥方式，臨床應(yīng)用廣泛，療效確鑿，且臍部給藥產(chǎn)品眾多，社會經(jīng)濟(jì)效益巨大，但目前對其作用機(jī)制的研究還較少。究其原因，主要是目前對經(jīng)絡(luò)穴位的研究尚不深入，對與人體相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動物穴位的確定尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本文的結(jié)果，可為相關(guān)研究提供借鑒。

2020年版《中國藥典》規(guī)定丁香飲片中丁香酚與肉桂飲片中桂皮醛含量分別不得低于11.0%和1.5%，丁香油與肉桂油中丁香酚和桂皮醛含量均不得低于75.0%，而丁香酚與桂皮醛均為揮發(fā)油類成分，極易經(jīng)皮滲透，因此選擇該兩種成分評價丁桂散經(jīng)皮給藥具有代表性［13］。丁桂散中揮發(fā)油透皮速率快，因此采血時間定為給藥后10 min即開始取樣?？紤]到采血對實(shí)驗(yàn)動物的影響，過長的取樣時間會對實(shí)驗(yàn)動物的生理狀況產(chǎn)生較大影響，繼而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，另外臨床每次臍部敷藥時間一般不超過24 h，因此將采血終點(diǎn)設(shè)為24 h。

經(jīng)皮給藥與口服相比，表現(xiàn)出緩慢吸收的性能，但經(jīng)皮給藥組AUC0t與口服組相比差異并不大，提示揮發(fā)油易于經(jīng)皮吸收，可以替代口服途徑而提高患者依從性。而臍部給藥與經(jīng)皮給藥組相比，在藥物的體內(nèi)藥動學(xué)行為上未體現(xiàn)出特異性的吸收行為，提示臍部給藥特異性的散寒止痛作用可能另有實(shí)現(xiàn)途徑。另可能由于大鼠臍部疤痕結(jié)構(gòu)較小，與旁開穴位皮膚結(jié)構(gòu)相近或一致，因此以大鼠為模型動物進(jìn)行臍部給藥經(jīng)皮吸收研究具有一定局限性。由于大鼠UC模型較之正常鼠體質(zhì)瘦弱，皮下脂肪較少，而丁香酚與肉桂酸均為強(qiáng)脂溶性成分，經(jīng)UC模型鼠皮膚吸收量大于正常鼠，AUC0t值高于正常鼠，該結(jié)果與本文作者的前期研究報道一致［14］。