玉米ZCN7在調(diào)控花期抗旱性中的作用

李燕，陶柯宇，胡悅，李永祥，張登峰，李春輝，何冠華，宋燕春，石云素，黎裕，王天宇，鄒華文，劉旭洋

玉米在調(diào)控花期抗旱性中的作用

李燕1，陶柯宇2，胡悅3，李永祥3，張登峰3，李春輝3，何冠華3，宋燕春3，石云素3，黎裕3，王天宇3，鄒華文1，劉旭洋3

1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434000；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

【目的】我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)多分布在干旱和半干旱的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)地區(qū)，干旱造成的玉米減產(chǎn)嚴(yán)重威脅國(guó)家糧食安全。作為異花授粉作物，開花期是玉米對(duì)干旱最為敏感的時(shí)期，干旱引起的散粉吐絲花期不遇將導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。因此，挖掘花期抗旱基因，并研究其功能，將為玉米抗旱種質(zhì)改良和品種培育提供理論支撐和基因資源?！痉椒ā坎扇∩镄畔W(xué)方法，對(duì)玉米基因組中24個(gè)ZCN基因（擬南芥的同源基因）的同源關(guān)系進(jìn)行分析。利用qRT-PCR和活體GFP熒光成像試驗(yàn)分析的組織表達(dá)模式。選取118份玉米多樣性自交系，在北京（2021和2022年）和新疆烏魯木齊（2022年）3個(gè)環(huán)境下開展不同水分處理的玉米開花期性狀調(diào)查，采用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序方法對(duì)及上下游區(qū)域的遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)，利用混合線性模型開展散粉-吐絲間隔的候選基因關(guān)聯(lián)分析獲得顯著關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)，同時(shí)，取花期葉片組織進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，分析顯著位點(diǎn)不同單倍型自交系中散粉-吐絲間隔及表達(dá)量的差別。構(gòu)建:的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米植株，在大田環(huán)境開展不同水分處理下的開花期鑒定和產(chǎn)量及相關(guān)性狀的鑒定，分析的花期抗旱功能?！窘Y(jié)果】玉米24個(gè)ZCN基因被分為15個(gè)FT類基因、6個(gè)TFL1類基因和3個(gè)MFT類基因，編碼的蛋白長(zhǎng)度為111—193個(gè)氨基酸，其中，ZCN7與ZCN8的親緣關(guān)系最近，二者蛋白序列的相似性為83.33%。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，在V12期表現(xiàn)出表達(dá)峰值，并且的啟動(dòng)子在成熟的擬南芥葉片邊緣高表達(dá)。候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)位于起始密碼子前1 001 bp的一個(gè)SNP位點(diǎn)具有最顯著的關(guān)聯(lián)信號(hào)，該位點(diǎn)AA和GG單倍型分別包含78和27個(gè)自交系，干旱條件下，A/A單倍型自交系的散粉-吐絲間隔顯著小于G/G單倍型，并且A/A單倍型的玉米表達(dá)量顯著高于G/G單倍型。對(duì)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米的田間表型鑒定，表明干旱和正常水分條件下轉(zhuǎn)基因玉米的散粉-吐絲間隔均小于野生型，其中，干旱條件下，OE1散粉-吐絲間隔較野生型縮小2.3 d，OE2較野生型縮小2.6 d；并且，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因玉米的單株產(chǎn)量和單株籽粒數(shù)均顯著高于野生型，而百粒重、粒長(zhǎng)、粒寬等性狀沒有顯著差異。【結(jié)論】玉米正調(diào)控玉米的抗旱性，其過表達(dá)能夠縮短干旱下的散粉-吐絲間隔，并增加籽粒產(chǎn)量。

玉米（L.）；抗旱性；開花期；ZCN

0 引言

【研究意義】玉米（L.）是重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，是世界上種植最廣泛的作物之一，也是中國(guó)種植面積最大的作物之一[1]。干旱是全球范圍影響玉米生產(chǎn)的主要脅迫因素。尤其是中國(guó)的玉米主產(chǎn)區(qū)大多分布在干旱和半干旱地區(qū)，干旱造成的玉米減產(chǎn)嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食安全。作為一種異花授粉植物，玉米在開花期受到的干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致雄穗和穗發(fā)育不同步，從而延長(zhǎng)散粉期和吐絲期間隔（anthesis-silking interval，ASI），延長(zhǎng)的散粉期和吐絲期間隔妨礙了玉米成功授粉，造成嚴(yán)重的籽粒產(chǎn)量損失[2]。因此，解析玉米花期抗旱性的分子機(jī)制，挖掘調(diào)控干旱條件下散粉期和吐絲期間隔的基因資源，對(duì)玉米抗旱種質(zhì)改良和新品種培育具有重要的理論和實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物的開花期性狀是重要的環(huán)境適應(yīng)相關(guān)性狀，受到生育期以及光周期、溫度等環(huán)境因素的共同調(diào)控。擬南芥（）和（）是控制花期的關(guān)鍵基因，這兩個(gè)基因均編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP），但FT和TFL1蛋白序列中一個(gè)氨基酸的差異造成了完全相反的功能，F(xiàn)T促進(jìn)開花，而TFL1抑制開花[3]。是控制擬南芥開花的關(guān)鍵基因，受光信號(hào)等多種途徑誘導(dǎo)在葉片中表達(dá)，編碼的蛋白通過長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織等，與編碼蛋白互作進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄激活花分生組織識(shí)別基因（）啟動(dòng)花的發(fā)育，過表達(dá)會(huì)使擬南芥出現(xiàn)早花表型，其缺失突變體表現(xiàn)出晚花表型[4-7]。水稻（）是的同源基因，該基因與14-3-3蛋白、OsFD1蛋白互作形成復(fù)合體，激活轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)促進(jìn)水稻開花，其過表達(dá)植株具有不依賴光周期的極早花表型[8-9]。在玉米基因組中有25個(gè)FT/TFL1基因的同源基因，命名為ZEA CENTRORADIALIS（ZCN）基因[10]。其中，是被研究最多的基因，被認(rèn)為在玉米花期調(diào)控中具有中心作用。Meng等[11]發(fā)現(xiàn)在光周期敏感的熱帶玉米材料中，的表達(dá)量被誘導(dǎo)開花的短日照環(huán)境激活，而在光周期不敏感的溫帶玉米材料中，的表達(dá)量在不同日照環(huán)境下比較穩(wěn)定，并且該基因的過表達(dá)能夠促使玉米提早開花。Lazakis等[12]發(fā)現(xiàn)玉米祖先大芻草的表達(dá)量被誘導(dǎo)開花的短日照環(huán)境激活，的表達(dá)量受（）的調(diào)控。Guo等[13]發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的一個(gè)SNP變異位點(diǎn)與玉米開花期顯著關(guān)聯(lián)，該變異位點(diǎn)通過影響與啟動(dòng)子的結(jié)合能力控制開花期。與具有最高的基因序列相似性，Mascheretti等[14]發(fā)現(xiàn)/具有相似的基因表達(dá)和組蛋白表觀修飾模式。然而，Danilevskaya等[10]對(duì)6個(gè)ZCN基因（—）的過表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，、和不僅控制玉米開花期，而且其過表達(dá)還顯著增加了雄穗的分枝數(shù)，而和對(duì)花期沒有影響但能夠控制雄穗的形態(tài)。表明ZCN基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中具有多重的分子生物學(xué)功能，也表明其家族內(nèi)的不同基因具有分化的功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ZCN基因調(diào)控玉米開花期的機(jī)制已有一些報(bào)道，然而，其在玉米花期抗旱中的功能仍鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以玉米為目的基因，通過qRT-PCR、組織表達(dá)分析等方法闡明的表達(dá)調(diào)控模式，采用自然群體研究的遺傳變異和表達(dá)量變異與花期抗旱的相關(guān)性，利用過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分析控制玉米花期抗旱性的功能，為玉米抗旱種質(zhì)改良和品種培育提供理論支撐和基因資源。

1 材料與方法

1.1 ZCN基因家族分析

從MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）網(wǎng)站中獲取ZCN家族基因的DNA序列、編碼區(qū)序列、蛋白序列和基因注釋信息。使用MEGA 11中CLUSTAL W方法對(duì)ZCN基因編碼蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，其中，參數(shù)Gap opening penalty設(shè)為10，Gap extension penalty設(shè)為0.1，其他選用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)；采用Neighbor Joining法構(gòu)建基因進(jìn)化樹，用500次迭代的自舉分析法（bootstrap）進(jìn)行分析。將ZCN家族基因蛋白序列提交至在線基因蛋白序列網(wǎng)站MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）檢測(cè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域（motif），參數(shù)設(shè)置為選擇系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。最后使用TBtools軟件[15]繪圖，將之前獲得的ZCN進(jìn)化樹結(jié)果、保守motif分析結(jié)果和基因注釋結(jié)果載入對(duì)應(yīng)模塊，選擇默認(rèn)參數(shù)，獲得進(jìn)化樹+Motifs+基因結(jié)構(gòu)組合圖。

1.2 ZCN7和ZCN8的表達(dá)模式分析

為了明確和在玉米不同生育時(shí)期及不同組織中的表達(dá)模式，利用玉米參考基因組自交系B73在溫室環(huán)境進(jìn)行種植培養(yǎng)，在不同的葉齡中取成熟的葉片組織，在開花期取雄穗、雌穗、花絲、根系等組織，每個(gè)組織5個(gè)單株混樣3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒（天根）提取組織的RNA樣品，利用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊）開展qRT-PCR分析，儀器為ABI Quantstudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ThermoFisher）。的qRT-PCR引物為5′-CCACTGCATGGCTACACTATA TAAT-3′和5′-CTTGGAGAATACTTTGTCTGATTAA TCA-3′，的引物為5′-GCTCAGACTGCAGCTT C-3′和5′-CTTGGCAGAAGTAGCCTATTG-3′，內(nèi)參基因的引物為5′-CCCTTCATCACCACGGACT AC-3′和5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3′，采用2-??Ct法計(jì)算基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品3次重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 ZCN7啟動(dòng)子表達(dá)模式分析

通過啟動(dòng)子表達(dá)分析進(jìn)一步明確的組織表達(dá)模式，采取EⅡ、EⅠ酶切位點(diǎn)將克隆的2 kb啟動(dòng)子序列連接至pCAMBIA3301載體，構(gòu)建:表達(dá)載體。利用熱激法將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至EHA105農(nóng)桿菌，使用沾花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。T1代的擬南芥種子在4 ℃春化3 d后播種，在16 h 25 ℃/8 h 22 ℃環(huán)境的溫室培養(yǎng)，播種后兩周噴施1‰濃度的草銨膦除草劑篩選陽(yáng)性植株，將陽(yáng)性擬南芥植株移栽至單獨(dú)的盆栽，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后使用植物活體成像儀檢測(cè)熒光信號(hào)，將濾光片調(diào)至紫外光，選擇激發(fā)時(shí)長(zhǎng)5 s，觀察、拍照并保存試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 玉米自然群體的田間花期抗旱性鑒定

從前期構(gòu)建的大規(guī)模自然群體中挑選118份代表性玉米自交系，在北京（2021和2022年）和烏魯木齊（2022年）開展2年多點(diǎn)的田間抗旱性鑒定。北京試驗(yàn)點(diǎn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所昌平實(shí)驗(yàn)基地的旱棚設(shè)施進(jìn)行，其中，旱區(qū)采用滴灌系統(tǒng)進(jìn)行灌溉，在播種后進(jìn)行一次灌溉，澆水量為450 m3·hm-2，此后停止?jié)菜猎囼?yàn)結(jié)束，有降雨時(shí)通過旱棚設(shè)施進(jìn)行遮雨；水區(qū)按一般田間管理。新疆試驗(yàn)點(diǎn)在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所安寧渠試驗(yàn)場(chǎng)開展，水旱區(qū)均采用滴灌系統(tǒng)精確控制土壤水分含量，其中水區(qū)每?jī)芍苓M(jìn)行一次灌溉，每次灌溉量為900 m3·hm-2；旱區(qū)同樣每?jī)芍苓M(jìn)行一次灌溉，每次灌溉量為450 m3·hm-2。各試驗(yàn)點(diǎn)均為兩行區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列設(shè)計(jì)，設(shè)3重復(fù)，行長(zhǎng)3 m，行距0.6 m，每行13株。人工記錄開花期，每個(gè)小區(qū)在超過一半植株散粉當(dāng)日記錄為散粉期，超過一半植株吐絲當(dāng)日記錄為吐絲期，并計(jì)算散粉-吐絲間隔。采用R語(yǔ)言的lme4包計(jì)算多環(huán)境表型數(shù)據(jù)的最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)（best linear unbiased prediction，BLUP）值。在V13期取每個(gè)小區(qū)的葉片組織，每個(gè)組織5個(gè)單株混樣品，提取RNA并對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，RNA提取及qRT-PCR方法同1.2。

1.5 ZCN7候選基因的關(guān)聯(lián)分析

采集118份玉米自交系的葉片樣品，采用CTAB法提取樣品的基因組DNA。根據(jù)序列及上游3 kb區(qū)域和下游1 kb區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)6對(duì)引物分段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序分析。6個(gè)擴(kuò)增子的引物序列分別為擴(kuò)增子1：5′-GACAACAAAGAACAGTTTTATCGATGC-3′和5′- ATCATTTACAAGGGGACTTGCTTC-3′，擴(kuò)增子2：5′- ACATGGCCATATGTACAATCTGTT-3′和5′-CTGCA GAAAAATAACCCTATGGGAC-3′，擴(kuò)增子3：5′-AGC CTTCCTCAACTCCAGTATAAAT-3′和5′-CTGATGT TGCCAACCAATTAAAGGAC-3′，擴(kuò)增子4：5′-GCCG GAGTCTGGATATATTGGTATT-3′和5′-CGTACCAC TGGCATAATACTTTCAAT-3′，擴(kuò)增子5：5′-ACTAC AATCAGAAGAGCACAACAC-3′和5′-GTGGGCCTA GGTTTTTTTATAGGGTG-3′，擴(kuò)增子6：5′-GACAACA TTGTTGATTGTTGATCGCC-3′和5′-CTGGAGTCAA TTTACTCGTGCATG-3′。測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN10軟件進(jìn)行拼接，使用MEGAX軟件將拼接好的序列進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)突變位點(diǎn)。采用TASSEL5軟件的混合線性模型（mixed linear model，MLM）進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析。

1.6 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米的創(chuàng)制

從B73的cDNA中PCR擴(kuò)增的編碼區(qū)序列，通過In-fusion無(wú)縫連接方法連接至替換了啟動(dòng)子的pCAMBIA3301載體，將構(gòu)建好的:載體轉(zhuǎn)化至EHA105農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的方法將過表達(dá)載體導(dǎo)入受體自交系B104。轉(zhuǎn)化體經(jīng)2代自交得到T2代種子，在每個(gè)世代通過草銨膦除草劑涂抹葉片方法檢測(cè)陽(yáng)性和陰性轉(zhuǎn)基因植株。

1.7 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米田間抗旱表型的鑒定

在新疆烏魯木齊利用自然干旱氣候環(huán)境開展轉(zhuǎn)基因材料的田間抗旱性鑒定，試驗(yàn)在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所安寧渠試驗(yàn)場(chǎng)開展。試驗(yàn)設(shè)水區(qū)和旱區(qū)2個(gè)處理，水旱區(qū)均采用滴灌系統(tǒng)精確控制土壤水分含量。其中，水區(qū)每?jī)芍苓M(jìn)行一次灌溉，每次灌溉量為900 m3·hm-2；旱區(qū)同樣每?jī)芍苓M(jìn)行一次灌溉，每次灌溉量為450 m3·hm-2。試驗(yàn)為四行區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列設(shè)計(jì)，行長(zhǎng)3 m，行距0.6 m，每行13株。水旱處理均設(shè)6個(gè)重復(fù)。在玉米的開花期記錄每株過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照植株的散粉期和吐絲期，并計(jì)算散粉-吐絲間隔。籽粒成熟后收獲四行區(qū)中間兩行的果穗，人工測(cè)量小區(qū)產(chǎn)量、單株產(chǎn)量，并利用智能化考種系統(tǒng)測(cè)量百粒重、粒長(zhǎng)、粒寬等性狀，采用LDS-1G型谷物水分測(cè)定儀測(cè)量籽粒含水量，籽粒折合14%水分含量進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 玉米ZCN基因家族分析

在玉米Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0基因組中共有24個(gè)ZCN基因，分布在除第1染色體外的其他9條染色體上，其中，第2染色體上分布最多（、、、和）?；蜻M(jìn)化樹表明，24個(gè)ZCN基因被分為三類：15個(gè)FT類基因（、、、、、、、、、、、、、和）、6個(gè)TFL1類基因（、、、、和）和3個(gè)MFT類基因（、和）（圖1）。ZCN基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為336—582 bp，編碼的蛋白長(zhǎng)度為111—193個(gè)氨基酸，具有較為保守的蛋白結(jié)構(gòu)。其中，ZCN7與ZCN8的親緣關(guān)系最近，其編碼的蛋白序列長(zhǎng)度分別為171和179個(gè)氨基酸，二者蛋白序列的相似性為83.33%。

2.2 ZCN7的基因表達(dá)模式分析

FT類基因主要在開花前的葉片中表達(dá)，通過長(zhǎng)距離運(yùn)輸至頂端分生組織等促進(jìn)植物開花[11]。通過對(duì)玉米不同葉齡的和表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在V12期表現(xiàn)出表達(dá)峰值，并且在V13期的表達(dá)量有所回落；而在V13期表現(xiàn)出表達(dá)峰值。和在雌穗、雄穗、花絲和根系中的表達(dá)量均較低（圖2-a）。此外，通過GFP熒光檢測(cè)對(duì)啟動(dòng)子的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP綠色熒光蛋白在成熟的擬南芥葉片邊緣呈現(xiàn)出較高的表達(dá)信號(hào)（圖2-b）。這一結(jié)果與在玉米成熟葉片的葉尖表達(dá)結(jié)果相似。

2.3 自然群體中ZCN7的候選基因關(guān)聯(lián)分析

利用118份多樣性玉米自交系分析的花期抗旱性功能。針對(duì)118份玉米自交系在2年3環(huán)境開展開花期抗旱性鑒定，采用6個(gè)擴(kuò)增子對(duì)及上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序，在5 717 bp的序列上共檢測(cè)到238個(gè)SNP變異和62個(gè)indel變異?；诨旌暇€性模型對(duì)干旱下的散粉-吐絲間隔進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于起始密碼子（ATG）前1 001 bp的一個(gè)SNP位點(diǎn)（SNP-1001）具有最顯著的關(guān)聯(lián)信號(hào)（圖3-a）。對(duì)SNP-1001的單倍型分析結(jié)果表明，AA和GG單倍型分別包含78和27個(gè)自交系，干旱下A/A單倍型自交系的散粉-吐絲間隔顯著小于G/G單倍型，而正常水分處理下的散粉-吐絲間隔沒有顯著差異。此外，不同水分處理下，不同單倍型間的散粉期和吐絲期也沒有明顯的差別。為了分析啟動(dòng)子前的顯著SNP變異對(duì)基因表達(dá)的影響，采用qRT-PCR方法對(duì)不同水分處理下葉片中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在干旱和正常處理下，A/A單倍型的玉米表達(dá)量均顯著高于G/G單倍型（圖3）。

a：ZCN7和ZCN8在不同組織中的表達(dá)分析；b：GFP熒光檢測(cè)

2.4 ZCN7過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性鑒定

為了驗(yàn)證影響玉米開花期和抗旱性的功能，構(gòu)建:過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米植株，經(jīng)過2代自交和除草劑、PCR篩選，獲得2個(gè)獨(dú)立的純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)化事件（OE1和OE2）。在不同水分處理下，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在株高、葉片數(shù)等形態(tài)特征上沒有顯著的差別（圖4-a—b）。對(duì)開花期的性狀鑒定結(jié)果表明，盡管在干旱和正常水分條件下轉(zhuǎn)基因植株的散粉期和吐絲期與野生型的差異沒有達(dá)到顯著水平，但是轉(zhuǎn)基因材料的散粉期較野生型延遲而吐絲期較野生型提前，這種相反的趨勢(shì)造成轉(zhuǎn)基因植株的散粉-吐絲間隔顯著（＜0.05）的小于野生型材料（圖4-c—h）。其中，OE1在干旱下的散粉-吐絲間隔較野生型縮小2.3 d，在正常水分處理下縮小1.9 d；OE2在干旱下的散粉-吐絲間隔較野生型縮小2.6 d，在正常水分處理下縮小1.0 d。

為了驗(yàn)證過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米減小的散粉-吐絲間隔是否影響籽粒產(chǎn)量，對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型玉米收獲后的單株產(chǎn)量、百粒重、粒長(zhǎng)、粒寬、單株籽粒數(shù)等性狀進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在正常水分處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因植株和野生型在產(chǎn)量及相關(guān)性狀上沒有顯著差異。而在干旱處理?xiàng)l件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米的單株產(chǎn)量顯著（＜0.05）高于野生型，其中OE1、OE2和野生型玉米的單株產(chǎn)量分別為31.9、35.0和36.9 g/株；并且OE1和OE2的單株籽粒數(shù)均顯著（＜0.05）高于野生型WT，其單株籽粒數(shù)分別為130.4、136.8和120.6粒/株。而在百粒重、粒長(zhǎng)、粒寬等性狀上轉(zhuǎn)基因玉米與野生型沒有顯著差異（圖5）。推測(cè)在干旱條件下轉(zhuǎn)基因玉米縮短的散粉-吐絲間隔增加了籽粒數(shù)從而增加了產(chǎn)量。

3 討論

3.1 已克隆的玉米抗旱基因具有重要的應(yīng)用潛力

我國(guó)的玉米主產(chǎn)區(qū)大多分布在干旱和半干旱地區(qū)，干旱造成的玉米減產(chǎn)嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食安全。抗旱玉米品種的培育和應(yīng)用是降低干旱危害的有效手段。近年來(lái)一些玉米抗旱相關(guān)基因被成功克隆并顯示出改良玉米抗旱性的應(yīng)用潛力。Wang等[16]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析克隆控制玉米苗期抗旱性的基因，該基因編碼一個(gè)位于液泡的質(zhì)子泵-焦磷酸水解酶，的過表達(dá)玉米植株相比對(duì)照在苗期干旱下具有顯著增高的存活率，在大田干旱下具有顯著減小的ASI和增高的單株產(chǎn)量。Tian等[17]發(fā)現(xiàn)在抗旱玉米自交系中的3′-UTR區(qū)域缺少一個(gè)28 bp的序列導(dǎo)致該基因mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，該基因的功能缺失突變體中氣孔響應(yīng)干旱脅迫的應(yīng)答減弱，并且過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料在干旱下的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，而在正常條件下的產(chǎn)量不受影響。Xiang等[18]發(fā)現(xiàn)在玉米自然群體中的表達(dá)量與抗旱程度負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)基因玉米和擬南芥均證明對(duì)抗旱性起負(fù)調(diào)控作用，其功能變異位點(diǎn)為5′-UTR區(qū)域的一段缺失導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)元件喪失，使丟失了干旱誘導(dǎo)表達(dá)的能力，從而提高了玉米的抗旱性。Mao等[19]克隆控制玉米苗期抗旱性的轉(zhuǎn)錄因子基因，在玉米自交系群體中該基因的表達(dá)量與抗旱性顯著正相關(guān)，的過表達(dá)玉米植株在干旱下具有顯著增強(qiáng)的存活率和水分利用效率，以及顯著減小的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率。Guo等[20]發(fā)現(xiàn)（）能夠控制玉米的產(chǎn)量和抗旱性，該基因的過表達(dá)玉米在干旱下表現(xiàn)顯著減小的ASI、果穗突尖長(zhǎng)度和顯著增加的結(jié)實(shí)率。過表達(dá)玉米能夠降低植株對(duì)乙烯信號(hào)的敏感性從而提高抗旱性[21]。經(jīng)過啟動(dòng)子編輯的增強(qiáng)表達(dá)玉米植株在干旱條件下的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，并且在正常水分條件下的產(chǎn)量與對(duì)照沒有差異[22]。Xiang等[23]發(fā)現(xiàn)能夠快速響應(yīng)干旱脅迫，該基因的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)玉米的抗旱性，并且ZmNAC49轉(zhuǎn)錄因子蛋白能夠直接結(jié)合到氣孔發(fā)育基因的啟動(dòng)子區(qū)域抑制該基因的表達(dá)。開花期是玉米抗旱性和環(huán)境適應(yīng)性的重要性狀，干旱引起的玉米花期不遇將造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)在花絲伸長(zhǎng)期的雌穗中，干旱脅迫抑制了大量細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)相關(guān)基因如擴(kuò)展蛋白（expansin）、水通道蛋白（auaporin）、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）的表達(dá)，導(dǎo)致花絲伸長(zhǎng)受阻；同時(shí)發(fā)現(xiàn)利用干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)一個(gè)擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)，能夠顯著降低轉(zhuǎn)基因植株在干旱下的散粉-吐絲間隔期。本研究克隆了玉米，該基因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米在干旱條件下較野生型對(duì)照具有顯著減小的散粉-吐絲間隔，對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的鑒定結(jié)果表明，過表達(dá)玉米較野生型具有顯著提高的單株籽粒數(shù)和籽粒產(chǎn)量，這些結(jié)果為玉米的抗旱種質(zhì)改良提供了具有應(yīng)用潛力的基因資源（圖4和圖5）。

a：采用混合線性模型對(duì)干旱下的散粉-吐絲間隔進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，X坐標(biāo)軸的0點(diǎn)為ZCN7的起始密碼子（ATG），圖下方為ZCN7的基因結(jié)構(gòu)，白色方框代表UTR區(qū)域，黑色方框代表編碼區(qū)，線條為內(nèi)含子。b—e：分別為干旱下不同單倍型的散粉-吐絲間隔、散粉期、吐絲期和ZCN7的表達(dá)比較；f—i：分別為正常條件下不同單倍型的散粉-吐絲間隔、散粉期、吐絲期和ZCN7的表達(dá)比較。采用Students’t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

干旱處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因（OE1和OE2）和野生型（WT）玉米的單株產(chǎn)量（a）、百粒重（b）、粒長(zhǎng)（c）、粒寬（d）、單株籽粒數(shù)（e）。正常水分下轉(zhuǎn)基因和野生型玉米的單株產(chǎn)量（f）、百粒重（g）、粒長(zhǎng)（h）、粒寬（i）、單株籽粒數(shù)（j）。采用Students’t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

3.2 一些花期相關(guān)基因在植物抗逆中發(fā)揮了重要作用

近年來(lái)，植物開花調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因被發(fā)現(xiàn)在抗逆、抗病、營(yíng)養(yǎng)高效等方面也發(fā)揮了重要作用。水稻（）編碼一個(gè)CONSTANS蛋白，Wei等[25]發(fā)現(xiàn)的功能缺失突變體對(duì)鹽脅迫十分敏感，該基因在鹽脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)會(huì)抑制質(zhì)膜鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)從而減少鹽離子在細(xì)胞內(nèi)的積累。大麥中生物鐘基因（）、、和（）等均能夠響應(yīng)高溫脅迫，其表達(dá)量在高溫脅迫下顯著升高[26]。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)是玉米抗莖腐病QTL位點(diǎn)的功能基因，的高表達(dá)能夠增強(qiáng)玉米的莖腐病抗性。在擬南芥中，基因具有抗稻瘟病菌和蚜蟲的功能，Yamaura等[28]發(fā)現(xiàn)基因和（）的擬南芥雙突變體表現(xiàn)增強(qiáng)的稻瘟病菌抗性。Lei等[29]發(fā)現(xiàn)的過表達(dá)擬南芥植株具有顯著增高的吲哚硫甙含量和更強(qiáng)的蚜蟲抗性。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)大豆中光周期調(diào)控蛋白、通過地上到地下部的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，并且在根系中被根瘤菌共生信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子CCaMK磷酸化修飾，促進(jìn)和互作從而激活根瘤起始關(guān)鍵基因，調(diào)控大豆根瘤形成。本研究發(fā)現(xiàn)玉米具有調(diào)控花期抗旱性的作用，其減小干旱下散粉-吐絲間隔期和提高籽粒產(chǎn)量的功能具有育種利用的潛力。而作為玉米成花素基因，是通過花期調(diào)控途徑或是其他的通路影響玉米的花期抗旱性，其分子機(jī)理還需要進(jìn)一步地研究分析。

4 結(jié)論

玉米ZCN基因家族成員的在玉米V12期表達(dá)量最高，且在擬南芥成熟葉片邊緣表達(dá)量較高，解析了自然群體中的等位變異和基因表達(dá)量變異，正調(diào)控玉米花期抗旱性，其優(yōu)異單倍型的玉米自交系具有顯著縮短的散粉-吐絲間隔，其過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米具有顯著增加的單株籽粒數(shù)和單株產(chǎn)量。

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Function of MaizeFlowering Stage

LI Yan1, TAO KeYu2, HU Yue3, LI YongXiang3, ZHANG DengFeng3, LI ChunHui3, HE GuanHua3, SONG YanChun3, SHI YunSu3, LI Yu3, WANG TianYu3, ZOU HuaWen1, LIU XuYang3

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434000, Hubei;2College of Agriculture Resources & Environment, Heilongjiang University, Harbin 150080;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【Objective】The main producing areas of maize is mostly located on the arid or semi-arid region that relying on the rainfed farming in China. The maize production losses caused by drought is a great threaten to food security. As a cross-pollinating crop, maize is mostly sensitive to water stress during flowering time. Drought at flowering stage will lead to asynchronous development between the male and female flower and cause massive grain yield loss. Thus, mining drought resistance related genes at flowering stage is important for maize drought resistance improvement and breeding. 【Method】In the present study, the phylogenic tree of 24 ZCN genes in maize genome, which is homologs ofgene, was build. The gene expression patterns ofwere analysis using qRT-PCR andGFP fluorescence imaging. A maize natural population consisting of 118 diverse inbred lines were planted in three environments, Beijing in 2021 and 2022 and Urumqi in 2022, to identify the flowering time related traits under different water treatments. The genomic variants aroundwere detected by PCR and Sanger sequencing. The candidate gene association analysis was performed based on mixed linear model and the significant associated variants with drought induced anthesis-silking interval was obtained. The gene expression level ofexpression were compared between different haplotypes of significant associated variant. The:overexpression transgenic maize were obtained, and the phenotypic performance was identified under different water treatments. 【Result】The 24 ZCN genes in maize genome included 15 FT like genes, 6 TFL1 like genes and 3 MFT like genes. The protein sequence of ZCN genes varied from 111 nn to 193 nn. The ZCN7 showed close relationship with ZCN8 and the protein sequence identity was 83.3% between the two genes.showed highest gene expression in the leaf blade at V12 stage. And the:vector was transformed toand the GFP showed enriched signal at the blade edge of mature leaf. The candidate gene association analysis revealed a SNP variant at 1001 bp upstream ofstart codon had highest association signal with drought induced anthesis-silking interval under drought. The A/A and G/G haplotypes of SNP-1001 included 78 and 27 inbred lines, respectively. The anthesis-silking interval of A/A haplotype lines were significantly lower than G/G lines. And thegene expression of A/A haplotype lines were significantly higher than G/G lines. In addition, theoverexpression transgenic lines showed significantly decreased anthesis-silking interval than wild type lines. Under drought, the anthesis-silking intervals of OE1 and OE2 were 2.3 and 2.6 days shorter than wild type lines. And the grain yield per plant and kernel number per plant of transgenic lines were significantly higher than wild type lines under drought, while the hundred kernel weight, kernel length and kernel width showed no significant difference. 【Conclusion】The maizeplayed positive role in drought resistance and its overexpression improved grain yield by reducing anthesis-silking interval under drought.

maize (L.); drought resistance; flowering time; ZCN

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.001

2023-03-09；

2023-05-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFD1200705）

李燕，E-mail：2863607340@qq.com。陶柯宇，E-mail：15704561709@163.com。李燕和陶柯宇為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者鄒華文，E-mail：zouhuawen@yangtzeu.edu.cn。通信作者劉旭洋，E-mail：liuxuyang@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）