基于網(wǎng)絡藥理學和數(shù)據(jù)挖掘探討中藥調控腫瘤相關性失巢凋亡的用藥規(guī)律

胡夢奕 屠小龍 王永生 張婷素

失巢凋亡是正常細胞脫離細胞外基質（ECM）的黏附，喪失細胞間、細胞和基質間的信號傳遞而發(fā)生的一種程序性凋亡，它可防止細胞黏附到異常的ECM 上異常生長，對機體發(fā)育和組織自身平衡具有重要作用[1]。和正常細胞不同，腫瘤細胞可通過多種途徑抵制失巢凋亡，使其在脫離ECM 的黏附和細胞間接觸后并不會發(fā)生細胞凋亡，反而重新獲得附著能力導致侵襲、擴散和轉移[2]。中醫(yī)藥具有多靶點、多通路的作用特點，在防治腫瘤、延緩進展、提高生活質量等方面具有顯著療效，日漸成為腫瘤綜合治療的重要組成部分[3-4]。有研究表明，姜黃素、人參皂苷、清金得生片等中藥單體或復方可誘導腫瘤細胞失巢凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]，但是目前中藥在調控失巢凋亡領域的研究仍較少，因此積極開展中藥調控腫瘤相關性失巢凋亡的相關研究具有重要意義。

本研究以失巢凋亡相關靶點為切入點，采用網(wǎng)絡藥理學的方法匹配出相應的化合物和中藥，構建多層次網(wǎng)絡并分析其關聯(lián)性，借助分子對接驗證靶點與化合物的相互作用，初步探討了中藥調節(jié)腫瘤相關失巢凋亡的物質基礎及一般用藥規(guī)律，以期為今后的理論研究、基礎實驗、臨床應用等提供思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集失巢凋亡相關靶點 在GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET、pharmGKB 等數(shù)據(jù)庫中檢索獲得失巢凋亡相關靶點，借助通用蛋白質數(shù)據(jù)庫（Uniprot）進行標準化處理，物種來源限制為人（Homo sapiens）。

1.2 篩選候選化合物和潛在靶點，構建“靶點-化合物”網(wǎng)絡 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索收集作用于失巢凋亡靶點的化合物信息，以ADME 參數(shù)[6-7]和Lipinski規(guī)則[8]為標準篩選候選化合物。具體如下：ADME 參數(shù)[6-7]：口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）≥-0.3，半衰期（HL）＞4，拓撲極性表面積（TPSA）＜60，可旋轉鍵數(shù)（RBN）≤10；Lipinski 規(guī)則[8]：分子量（MW）＜500 Da，氫鍵供體（Hdon）＜5，氫鍵受體（Hacc）＜10，脂水分配系數(shù)（ALog P）＜5。通過候選化合物反向映射靶點，從而獲得潛在靶點，將兩者導入Cytoscape 3.7.2 軟件中構建“靶點-化合物”網(wǎng)絡，并進行拓撲學分析。采用R 4.0.3 軟件對潛在靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。

1.3 分子對接 利用Autodock Vina 軟件對度值前5 的靶點和化合物進行分子對接，以驗證兩者之間作用關系的可信度，若對接得分＜-5.0，則認為其結合活性較好，若得分＜-7.0，則認為兩者之間有強烈的對接活性。

1.4 獲取相關中藥，構建“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集候選化合物所對應的中藥，并根據(jù)《中國藥典》2015 年版[9]、全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學》[10]和《中國臨床藥物大辭典》[11]進行篩選，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構筑“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡并進行相關分析。

1.5 中藥數(shù)據(jù)整理分析 參照《中國藥典》2015 年版[9]、全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學》[10]和《中國臨床藥物大辭典》[11]對“1.4”中獲得的中藥匹配性味歸經(jīng)并進行統(tǒng)計分析。拆分性味歸經(jīng)的組合，如藥味“味辛苦”拆分為“味辛”“味苦”，歸經(jīng)“歸心、肝、脾經(jīng)”拆分為歸“心經(jīng)”“肝經(jīng)”“脾經(jīng)”等。

2 結 果

2.1 失巢凋亡相關潛在靶點獲取及機制分析 檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET、pharmGKB后共獲得Anoikis 相關靶點313 個，能匹配到化合物的靶點有116 個，符合ADME 參數(shù)[6-7]和Lipinski 規(guī)則[8]的化合物所對應的靶點有26 個，所以將這26 個靶點定義為Anoikis 的潛在靶點（見表1）。對26 個潛在靶點進行KEGG 富集分析（見圖1），結果顯示涉及多條腫瘤相關通路，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、JAK-STAT 信號通路、HIF-1 信號通路等，并與多種惡性腫瘤相關，由此進一步驗證了失巢凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，也證實了本研究所選靶點的可靠性。

圖1 潛在靶點KEGG 富集分析

表1 調控失巢凋亡的潛在靶點

2.2 候選化合物篩選及“靶點-化合物”網(wǎng)絡構建經(jīng)潛在靶點映射、ADME 參數(shù)和Lipinski 規(guī)則篩選，共獲得198 個候選化合物，將候選化合物與潛在靶點構建“靶點-化合物”網(wǎng)絡（見圖2）。該網(wǎng)絡由224個節(jié)點和311 條邊組成，網(wǎng)絡中節(jié)點代表活性成分或靶點，邊線代表兩者之間的相互聯(lián)系，度值為節(jié)點間相連的路徑數(shù)目，度值越大說明該節(jié)點在此網(wǎng)絡中的調控作用越大，其生物學功能也就越重要。度值前5 的化合物分別為玫瑰樹堿（ellipticine，MOL0091 35）、丹參酮ⅡA（tanshinone Ⅱa，MOL007154）、薯蕷皂 甙（diosgenin，MOL000546）、苦 參 堿（matrine，MOL005944）、隱丹參酮（cryptotanshinone，MOL00708 8），分別對應10、8、8、5、5 個作用靶點。度值前5 的靶點為前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、血管內皮生長因子受體2（KDR）、白細胞介素6（IL6）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3），分別對應188、79、4、4、4 個化合物。

圖2 失巢凋亡相關“靶點-化合物”網(wǎng)絡

2.3 分子對接 將高度值靶點PTGS2、AR、KDR、IL6、CASP3 與高度值化合物玫瑰樹堿（ellipticine）、丹參酮ⅡA（tanshinone Ⅱa）、薯蕷皂甙（diosgenin）、苦參堿（matrine）、隱丹參酮（cryptotanshinone）進行分子對接，雖然凋亡調節(jié)因子Bcl-2（BCL2）、Bcl-2 樣蛋白1（BCL2L1）、半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、半胱氨酸蛋白酶9（CASP9）度值低，但與失巢凋亡關系較為緊密，故也作為受體進行對接。結果顯示，各靶點與化合物的對接得分均＜-5.0 kcal/mol，其中最低為-9.9 kcal/mol，最高為-6.0 kcal/mol（見圖3）。以二維圖展示9 個靶點與其最佳配體的對接結果（見圖4），可見各配體均嵌入靶點的活性口袋中，通過疏水作用、形成氫鍵等形式與靶點多個殘基發(fā)生相互聯(lián)系。

圖4 分子對接結果二維圖

2.4 獲取相關中藥，構建“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡198 種候選化合物經(jīng)匹配獲得相關中藥共220 味，其中8 味未被《中華人民共和國藥典》（2015 年版）[9]、全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學》[10]、《中國臨床藥物大辭典》[11]收錄，故最終共收集212 味中藥。以此構建“化合物-中藥”網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡中含有410 個節(jié)點，463 條邊，度值前5 的中藥為延胡索、丹參、白屈菜、苦地丁、黃柏。通過候選化合物的橋接作用收集到靶點數(shù)前20 的中藥為丹參、訶子、胡蘆巴、天冬、菝葜、楮實子、粉萆薢、瓜蒂、黃精、黃藥子、苦參、兩頭尖、龍葵、綿萆薢、前胡、山豆根、山藥、土茯苓、菟絲子、知母，推測此20 味中藥對調控失巢凋亡具有較大的作用，中藥對應度值及靶點情況見圖5。選取度值≥4 的中藥及關聯(lián)化合物、靶點構建“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡（177 個節(jié)點，422 條邊）（見圖6），可供失巢凋亡相關中藥基礎與臨床研究參考。

圖5 調控失巢凋亡中藥的對應度值及靶點情況

圖6 調控失巢凋亡“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡

2.5 中藥性味歸經(jīng)分析 通過對212 味中藥的性味歸經(jīng)進行統(tǒng)計分析，結果顯示對失巢凋亡具有潛在調控作用的中藥藥味以苦味出現(xiàn)頻次最高，其次為辛味、甘味；藥性方面以寒性最多，其次為溫性、平性；歸經(jīng)方面以入肝經(jīng)最多，其次為肺經(jīng)、胃經(jīng)，見表2、圖7。

圖7 調控失巢凋亡中藥的歸經(jīng)分布

表2 調控失巢凋亡中藥的性味分布

3 討 論

生理狀態(tài)下，上皮或內皮細胞借助于其錨定依賴性存活于ECM 及細胞之間，一旦其黏附效應消失則會發(fā)生脫落進而引起失巢凋亡，該過程主要通過線粒體途徑（內源性）和死亡受體途徑（外源性）實現(xiàn)[12]。腫瘤細胞可通過自分泌或旁分泌機制使其自身具有失巢凋亡抗性，還可通過PI3K-Akt 信號通路、酪氨酸激酶受體通路、MAPK 通路、整合素通路、經(jīng)典Wnt/β-catenin 通路、TGF-β/Smad 通路等抑制失巢凋亡，從而經(jīng)淋巴或血液循環(huán)發(fā)生侵襲、擴散和轉移[13]。本研究從GeneCards、DrugBank、OMIM 等數(shù)據(jù)庫搜索、經(jīng)TCMSP 匹配篩選后獲得26 個潛在靶點，根據(jù)KEGG 結果可證實，納入的潛在靶點具有高度可靠性。通過“靶點-化合物”網(wǎng)絡篩選，度值前5的靶點為PTGS2、AR、KDR、IL6、CASP3。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），大量研究證實COX-2 過表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[14]。E-鈣黏素是維持細胞間黏附性和穩(wěn)定正常組織結構的主要因子，負責細胞與外界的錨定連接。一方面，COX-2 通過前列腺素E2（PGE2）誘導產(chǎn)生E-鈣黏素轉錄抑制蛋白，抑制E-鈣黏素基因的轉錄；另一方面，COX-2通過前列腺素H2（PGH2） 誘導基質金屬蛋白酶（MMP）大量表達，對E-鈣黏素進行水解，COX-2 通過以上兩條途徑下調E-鈣黏素的表達，使得腫瘤細胞的表面黏附性較正常細胞低。研究發(fā)現(xiàn)，失巢凋亡相關通路Wnt/β-catenin 通路、整合素通路也均與COX-2 密切相關[15]。KDR[16-17]、AR[18]、IL6[19]也同樣被證實在調控腫瘤細胞失巢凋亡過程中扮演重要角色。無論是死亡受體途徑還是線粒體途徑，均是通過激活半胱氨酸蛋白酶來進行調節(jié)，包括CASP3、CASP8、CASP9 等[13]；Bcl-2 蛋白家族則是線粒體膜電位和通透性的重要調節(jié)因子，在失巢凋亡內源性途徑中起到重要作用，故本研究將BCL2、BCL2L1、CASP8、CASP9 也納入后續(xù)的分子對接研究。

細胞凋亡與細胞增殖相互對立又相互關聯(lián)，共同維持生物體內細胞的動態(tài)平衡，其屬性可以從中醫(yī)陰陽理論的角度來進行認識，細胞增殖屬陽，細胞凋亡屬陰，兩者保持動態(tài)平衡，一旦一方出現(xiàn)異常，陰陽失衡則出現(xiàn)病理狀態(tài)，失巢凋亡屬于凋亡的一種類型，故歸屬于陰，腫瘤的發(fā)生正是由于細胞的陽盛（過度增殖）而陰衰（凋亡減退），此即為細胞層面的陽盛陰衰，當?shù)蛲鏊俣却笥谠鲋乘俣?，即細胞增殖與凋亡趨向于“陰平陽秘”時，則腫瘤消退[5，20]。

中醫(yī)藥抗腫瘤具有療效顯著、副作用低等優(yōu)點，呈現(xiàn)多成分、多靶點、多通路的綜合模式。從“靶點-化合物”網(wǎng)絡可知，多個化合物可與多個靶點發(fā)生相互作用，其中度值前5 的化合物分別為玫瑰樹堿、丹參酮ⅡA、薯蕷皂甙、苦參堿、隱丹參酮，以上化合物均被證實具有抗腫瘤作用[21-24]，其中苦參堿可通過激活抑癌基因p53、凋亡調節(jié)因子Bax 依賴的caspase-3，并阻斷ECM-整合素介導的細胞存活途徑，從而控制失巢凋亡誘導腫瘤細胞凋亡[25]。丹參酮ⅡA、隱丹參酮均為丹參提取物，研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 能夠阻斷TGF-β/Smad 通路、上調E-鈣黏素蛋白，防止形成上皮-間質（EMT）轉化，誘導失巢凋亡[26-27]。隱丹參酮則可通過抑制JAK2/STAT3 和PI3K/Akt/NF-κB 信號通路，改變Bcl-2 家族的表達而誘導腫瘤細胞發(fā)生失巢凋亡[28]。本研究共篩選獲得212 味中藥與失巢凋亡相關，綜合度值及靶點數(shù)情況，尤以丹參與失巢凋亡的關系最為密切。薯蕷皂苷是一種甾體類皂苷，廣泛存在于各種植物中，實驗證實薯蕷皂苷能夠促進活性氧（ROS）產(chǎn)生、調節(jié)Bcl-2 蛋白家族的平衡、激活caspase 級聯(lián)反應，參與線粒體途徑和死亡受體途徑[29]。玫瑰樹堿是從夾竹桃植物的葉和樹皮中提取或者經(jīng)由化學合成的一種生物堿，它可增加細胞內的ROS，激活MAPKs 誘導腫瘤細胞凋亡[30]，關于玫瑰樹堿與失巢凋亡的研究較少，值得更進一步的探索。分子對接結果表明，以上化合物與9 個靶點對接良好，尤以丹參酮ⅡA 與AR、薯蕷皂苷與PTGS2 對接活性最佳，為今后研究提供了新的思路與切入點。

本研究結果表明，潛在可調控失巢凋亡的中藥藥味多為苦、辛、甘；藥性以寒、溫、平為主?？辔端幠苄鼓茉锬軋裕鼓[瘤治療中常常運用苦味藥來達到瀉火存陰、降逆通結的功效[31]，結合藥性以苦寒居多，藥理學研究證實苦寒中藥具有誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、抑制腫瘤侵襲轉移、抑制腫瘤血管生成、逆轉腫瘤多藥耐藥性作用、抑制端粒酶活性等作用，并且還能夠提高機體免疫功能[32]。辛味藥能散能行，具有行氣活血之效，中醫(yī)認為腫瘤發(fā)病多與氣滯、血瘀有關，故臨床常用行氣活血化瘀法來治療腫瘤，用藥尤以辛溫之品為多。辛苦配伍、寒溫并用，既可制約偏盛，又取“辛開苦降”之意以斡旋人體氣機。甘味藥能補、能和、能緩，具有緩急止痛、補益和中、調和藥性的作用。腫瘤形成的根本在于正虛，且腫瘤為消耗性疾病，癌毒日久耗傷正氣而氣血俱虛，甘味藥能夠滋補強壯，補益氣血陰陽，改善腫瘤患者正虛的狀態(tài)。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，甘味藥含有糖類、氨基酸、蛋白質、維生素等，可增強機體免疫功能，具有“扶正”之效[33-34]。辛甘合用更能溫陽補虛?！秲冉?jīng)》有云：“辛甘淡屬陽，酸苦咸屬陰”，藥性中寒涼屬陰，溫熱屬陽，辛苦寒溫合用，加之甘味藥調和補虛，可解寒熱錯雜之態(tài)，散壅塞固結之邪，且無偏勝之害，這也正是中醫(yī)陰陽平衡的體現(xiàn)。在歸經(jīng)方面則以入肝、肺、胃經(jīng)為多。肝主疏泄、調暢氣機，從左而升；肺主氣、主治節(jié)，從右而降；脾胃居中，為氣機升降之樞紐，三者共同維系人體之氣正常運行。“百病皆生于氣”，腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了正氣不足之外，還與氣機失調有關[35]，而且肝藏血、脾胃為氣血生化之源、肺朝百脈，運用入肝、肺、胃經(jīng)的藥物則可發(fā)揮通行血脈、補益氣血、祛瘀生新之效。綜上推測失巢凋亡功能障礙的中醫(yī)病機或為氣機失調、氣血不和，久而耗傷正氣，遣方用藥需注意調暢氣機，調和氣血，扶正培本。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，從失巢凋亡相關靶點入手，構建了“靶點-化合物”“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡，系統(tǒng)探討了中藥調控腫瘤相關性失巢凋亡的物質基礎和一般規(guī)律，為進一步實驗研究和臨床遣方用藥提供思路，具有一定的研究意義。但是，本研究仍有一定的局限性，雖然本研究通過多個數(shù)據(jù)庫盡可能地獲得較為全面的相關信息，可是由于數(shù)據(jù)庫更新時限，可能導致靶點、化合物和中藥收集不全。此外，本研究只考慮到靶點、化合物、中藥之間是關系數(shù)量，未兼顧到靶點與化合物之間的量效關系、臨床應用時中藥劑量、煎煮等各種因素帶來的影響，故所得結果仍需要進一步的實驗驗證。