慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞CD36 mRNA、血清ApoE 水平對急性加重期發(fā)生的預測價值

於建平 李國平 陳 凱 沈佳程

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性氣道炎癥性疾病，其特征是持續(xù)性氣流受限、肺功能加速喪失和不可逆的肺損傷[1]。COPD 患者表現(xiàn)出肺功能突然惡化，稱為COPD 急性加重期（acute exacerbation of COPD，AECOPD），其特征是出現(xiàn)各種快速惡化的呼吸道癥狀，可增加死亡風險[2]。有研究顯示，預測AECOPD 發(fā)生風險和疾病嚴重程度可減少AECOPD 患者再入院次數(shù)，改善預后[3]。白細胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）又稱為清道夫受體B2，是一種在各器官中廣泛表達的多功能受體，可參與多種病理生理過程，包括免疫調(diào)節(jié)和代謝調(diào)節(jié)[4]。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一種重要的多態(tài)性糖基化蛋白，主要由肝臟產(chǎn)生和代謝，肺、腎、卵巢等可少量合成。有研究表明，ApoE 參與膿毒癥等感染性疾病炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)[5]。本研究通過檢測COPD 患者外周血中CD36、ApoE 的表達情況，分析二者相關(guān)性以及與疾病嚴重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021 年6 月至2022 年5 月于浙江省湖州市中心醫(yī)院確診為COPD 患者96 例，其中急性加重期患者為AECOPD 組（n=50），穩(wěn)定期患者為穩(wěn)定組（n=46）。選取同期來醫(yī)院體檢且與COPD患者一般資料匹配的健康人群40 名為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過（批件號：2021LSZ-041），所有樣品采集均取得受試者知情同意。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）所有患者均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》[6]中的診斷標準；（2）資料齊全。排除標準：（1）有精神病和溝通障礙者；（2）3 個月內(nèi)進行過手術(shù)，有創(chuàng)傷者；（3）合并其他肺部疾病如肺結(jié)核、肺部腫瘤者；（4）伴有免疫系統(tǒng)功能缺陷、心血管疾病者。

1.3 主要試劑與儀器 人腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β、ApoE 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、PCR 試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司（批號sc-2097、sc-3028、sc-3527、sc-1043、sc-7112）；C 反應(yīng)蛋白（CRP）檢測試劑盒、Trizol試劑購自南京基蛋生物科技股份有限公司（批號1627-9、1891-12）；酶標儀、肺功能檢測儀、熒光定量PCR 儀購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司（型號FlexA-200、ST-150、7300）。

1.4 標本采集和保存 COPD 患者于入院后次日清晨、健康人群于體檢當日采集空腹靜脈血8 mL。其中5 mL 血液樣本采用3000 r/min 離心處理18 min 后取上層血清置于-70 ℃保存?zhèn)溆?；? mL 血液樣本利用密度梯度離心法進行外周血單個核細胞（PBMCs）分離，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清炎性因子、ApoE 水平和肺功能指標檢測取1.4 中保存的血清，解凍后采用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、ApoE 水平，免疫比濁法檢測血清CRP 水平；采用肺功能檢測儀測定所有受試者第1 秒用力呼氣容積（FEV1）、用力肺活量（FVC），計算第1 秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）、第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）。

1.6 PBMCs 中CD36 mRNA 水平檢測 取1.4 中保存的PBMCs，解凍后采用Trizol 法提取PBMCs 總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA 為模板，β-actin 為參照，進行PCR 擴增，擴增條件：93 ℃3 min，90 ℃17 s，59 ℃22 s，66 ℃13 s，30 個循環(huán)。引物序列：CD36 mRNA正 向 5' -ATCGACTGCATTCGACGATGC -3'，CD36 mRNA 反 向5'-GAACTGACTTGACAGTAGCTC-3'；β-actin 正向5'-GACTTAGCATTGCCTCAGCA-3'，βactin 反向5'-ATACGAAGTACCATAGACGA-3'。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司設(shè)計合成。以2-ΔΔCt法計算PBMCs 中CD36 mRNA 水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗；Pearson 法分析COPD 患者PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 水平與炎性因子、肺功能指標的相關(guān)性；受試者工作特征（ROC）曲線評價PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 對COPD 患者急性加重期發(fā)生的預測價值，Z 檢驗進行曲線下面積（AUC）比較；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組受試者一般資料比較 三組受試者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；穩(wěn)定組和AECOPD 組吸煙史比例均高于對照組（P＜0.05），但穩(wěn)定組和AECOPD 組吸煙史比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組受試者一般資料比較

2.2 三組受試者血清炎性因子和肺功能指標比較對照組、穩(wěn)定組、AECOPD 組血清TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP 水平依次升高，F(xiàn)EV1/FVC、FEV1%pred 水平依次降低（P＜0.05）。見表2。

表2 三組受試者血清炎性因子和肺功能指標比較（±s）

表2 三組受試者血清炎性因子和肺功能指標比較（±s）

注：對照組為健康人群；穩(wěn)定組為穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者；AECOPD 組為急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白細胞介素-6；IL-1β 為白細胞介素-1β；CRP 為C 反應(yīng)蛋白；FEV1/FVC 為第1 秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值；FEV1%pred為第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比；與對照組比較，aP＜0.05；與穩(wěn)定組比較，bP＜0.05

組別對照組穩(wěn)定組AECOPD 組F/χ2 值P 值例數(shù)40 46 50 TNF-α（μg/L）0.95±0.12 1.25±0.38a 1.46±0.49ab 20.448<0.001 IL-6（pg/mL）36.21±7.02 49.11±7.80a 66.84±6.75ab 206.136<0.001 IL-1β（pg/mL）7.33±2.11 12.10±4.84a 18.68±3.41ab 108.561<0.001 CRP（mg/L）2.32±1.38 7.32±2.25a 40.56±4.56ab 2040.271<0.001 FEV1/FVC（%）86.26±5.21 55.82±4.15a 36.12±6.08ab 1023.020<0.001 FEV1%pred（%）91.23±13.22 54.71±5.10a 36.23±3.12ab 536.698<0.001

2.3 三組受試者PBMCs 中CD36 mRNA 和血清ApoE 水平比較 對照組、穩(wěn)定組、AECOPD 組PBMCs中CD36 mRNA 和血清ApoE 水平依次升高（P＜0.05）。見表3。

表3 三組受試者PBMCs 中CD36 mRNA和血清ApoE 水平比較（±s）

表3 三組受試者PBMCs 中CD36 mRNA和血清ApoE 水平比較（±s）

注：對照組為健康人群；穩(wěn)定組為穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者；AECOPD 組為急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者；CD36 為白細胞分化抗原36；ApoE 為載脂蛋白E；與對照組比較，aP＜0.05；與穩(wěn)定組比較，bP＜0.05

組別對照組穩(wěn)定組AECOPD 組F 值P 值例數(shù)40 46 50 CD36 mRNA 1.08±0.06 2.05±0.19a 3.56±0.41ab 45.879<0.001 ApoE（mg/L）35.55±5.83 43.55±8.57a 58.23±11.56ab 71.831<0.001

2.4 COPD 患者PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE水平與炎性因子、肺功能指標的相關(guān)性分析 Pearson 法分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定組患者PBMCs 中CD36 mRNA 與血清ApoE 水平呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.010），AECOPD 組患者PBMCs 中CD36 mRNA 與血清ApoE 水平呈正相關(guān)（r=0.451，P<0.001）（見圖1～2）。穩(wěn)定組及AECOPD 組患者PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 水平均與血清TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP 呈正相關(guān)，與FEV1/FVC、FEV1%pred 呈負相關(guān)（P＜0.05），見表4～5。

圖1 穩(wěn)定組患者PBMCs 中CD36 mRNA 與血清ApoE 水平的相關(guān)性（n=46）

圖2 AECOPD 組患者PBMCs 中CD36 mRNA 與血清ApoE水平的相關(guān)性（n=50）

表4 穩(wěn)定組患者PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 水平與炎性因子、肺功能指標的相關(guān)性

表5 AECOPD 組患者PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE水平與炎性因子、肺功能指標的相關(guān)性

2.5 PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 對COPD患者急性加重期發(fā)生的預測價值 ROC 曲線結(jié)果顯示，PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 各自單獨預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的AUC 分別為0.887、0.871；CD36 mRNA 和ApoE 二者聯(lián)合預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的AUC 為0.966；二者聯(lián)合預測的AUC 高于CD36 mRNA、ApoE 單獨預測的AUC（Z=2.056、2.472，P=0.040、0.013）。見圖3、表6。

圖3 PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的ROC 曲線

表6 PBMCs 中CD36 mRNA、血清ApoE 對COPD 患者急性加重期發(fā)生的預測價值

3 討 論

COPD 已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)成逐漸上升趨勢，已成為我國居民主要死亡原因及疾病負擔[7]。COPD 患者多有呼吸困難、喘息、咳嗽、黏液分泌過多、疲勞和體重減輕等癥狀，使身體活動、社會和職業(yè)生活受限，增加了對他人的依賴，并會導致焦慮和抑郁等心理問題[8]。COPD 的發(fā)病機制普遍認為是慢性炎癥使肺部T 淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞釋放炎性介質(zhì)，造成蛋白酶和抗蛋白酶失衡以及氧化抗氧化失衡，最終導致肺部結(jié)構(gòu)被破壞[9]。

CD36 屬于B 類清道夫受體家族，在長鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運及代謝性炎癥的發(fā)生中起著重要作用，是一種88 kDa 糖基化跨膜蛋白，其功能廣泛，參與多種生理、病理過程[10]。如在巨噬細胞中CD36 表達可誘導炎癥反應(yīng)，是促炎和氧化途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD36 在動脈粥樣硬化、肥胖、非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病等疾病中表達均增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組、穩(wěn)定組、AECOPD 組PBMCs 中CD36 mRNA、血清TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP 水平依次升高，F(xiàn)EV1/FVC、FEV1%pred 水平依次降低；穩(wěn)定組和AECOPD 組患者CD36 mRNA 與血清TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP 呈正相關(guān)，與FEV1/FVC、FEV1%pred 呈負相關(guān)，提示PBMCs 中CD36 mRNA 水平與COPD 患者病情相關(guān)，CD36 mRNA 水平越高炎癥反應(yīng)越嚴重，肺功能越差，對評估患者病情具有重要價值。ROC 曲線結(jié)果顯示，PBMCs 中CD36 mRNA 水平預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的AUC 為0.887，對應(yīng)的敏感度為78.30%，特異度為84.78%，提示PBMCs 中CD36 mRNA 水平可在一定程度上預測COPD 患者急性加重期的發(fā)生。

人類載脂蛋白E 存在三種主要的亞型，ApoE2、ApoE3 和ApoE4，分別由ε2、ε3 和ε4 等位基因編碼[13]。ApoE4 異構(gòu)體已被證明與動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病和骨質(zhì)疏松癥有關(guān)[14]。蕭鯤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ApoE 基因多態(tài)性參與COPD 患者病情的發(fā)展以及認知功能損害過程，是COPD 發(fā)生的危險因素，而且ApoE 主要參與脂質(zhì)代謝以及運輸，在機體免疫應(yīng)答以及調(diào)節(jié)中也具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組、穩(wěn)定組、AECOPD 組血清ApoE 水平依次升高，穩(wěn)定組和AECOPD 組患者ApoE 與TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP 呈正相關(guān)，與FEV1/FVC、FEV1%pred 呈負相關(guān)，表明ApoE 參與COPD 的發(fā)生和發(fā)展進程。本研究還發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定組和AECOPD 組患者PBMCs 中CD36 mRNA 與血清ApoE 水平呈正相關(guān)，提示二者可能存在相互影響的關(guān)系共同參與COPD 的發(fā)生和進展。ROC 曲線結(jié)果顯示，血清ApoE 水平預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的AUC 為0.871，敏感度為90.02%，特異度為73.91%；CD36 mRNA 和ApoE二者聯(lián)合預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的AUC為0.966，敏感度為92.11%，特異度為81.30%。提示PBMCs 中CD36 mRNA 和血清ApoE 二者聯(lián)合應(yīng)用于預測COPD 患者急性加重期發(fā)生的臨床價值優(yōu)于單一指標。

綜上所述，COPD 患者PBMCs 中CD36 mRNA和血清ApoE 均呈高表達，二者呈正相關(guān)關(guān)系，二者可能參與調(diào)控COPD 的發(fā)生、發(fā)展，且對COPD 患者急性加重期發(fā)生具有一定的預測價值。