白皮杉醇對糖尿病心肌病模型大鼠的治療機制研究

金秦然 陳翩翩

糖尿病心肌?。―CM）是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DCM 可導(dǎo)致心力衰竭，包括心肌細胞肥大、壞死以及心肌纖維化[1-3]。氧化應(yīng)激、炎癥、心肌能量代謝和鈣平衡異常是DCM 的發(fā)病機制[4-6]。白皮杉醇（Pic）是白藜蘆醇衍生物，主要存在于葡萄、大黃、甘蔗等植物中。Pic 是一種多酚類化合物，具有多種生物學(xué)活性，有抗炎、抗氧化、提高機體免疫力等作用[7-10]。此外，Pic 對高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化和血管生成具有正向作用[11]，表明其在心血管疾病中有一定治療潛力。本文主要研究Pic 對DCM 模型大鼠的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試 劑 大鼠心肌細胞H9c2（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號G4511）。鏈脲佐菌素（STZ，Sigma 公司，批號S0130）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號20190220、20190307）；原位末端凋亡法（TUNEL）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號C1088），蘇木素伊紅染色（HE）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20220324），天狼猩紅染色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號GP1033），CCK-8 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號CA1210），核因子-κB（NF-κB）p65 抗體（碧云天生物有限公司，批號AF1234）。

1.2 大鼠心肌細胞H9c2 的培養(yǎng) 將大鼠心肌細胞H9c2 分為正常組、高糖（HG）組和HG+Pic 組。H9c2大鼠心肌細胞在含有5.5 mmol/L 葡萄糖、10%FBS、100 U/mL 青霉素，以及100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而HG 組細胞被孵育在含有33 mmol/L葡萄糖的DMEM 中。將細胞以5×105/mL 密度接種在培養(yǎng)皿中，并在37 ℃下孵育24 h。將正常組細胞和HG 組細胞以8000 個/孔的密度接種在96 孔板中，孵育24 h 后，HG 組細胞給予0.01 mmol/L Pic 后繼續(xù)培養(yǎng)，在培育24、48 h 時，分別統(tǒng)計細胞的活性。H9c2 細胞在HG 中培養(yǎng)后，給予Pic 繼續(xù)培育48 h。經(jīng)4%的多聚甲醛固定，洗滌，封閉，一抗（p65 抗體），熒光標記二抗以及細胞核DAPI 熒光染色，封片即可，通過p65 細胞免疫熒光染色實驗對比三組細胞p65 水平。

1.3 DCM 模型建立及分組 健康的7～8 周齡SD 大鼠48 只，雄性，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，均購自上海斯萊克實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009，所有動物實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心機構(gòu)動物倫理與使用委員會批準，倫理審批號：wydw2016-0282。將大鼠飼養(yǎng)在20～24 ℃、濕度45%～55%，12 h 循環(huán)照明的環(huán)境中，自由攝食飲水。按照隨機數(shù)字表法將48 只大鼠分為正常組、DCM 組、Pic-L 治療組和Pic-H 治療組，每組12 只。DCM 組、Pic-L 治療組和Pic-H 治療組大鼠單次腹腔注射70 mg/kg STZ，注射后3 d 空腹血糖＞16.7 mmol/L則成功建立糖尿病模型，6 周后即可發(fā)生DCM[12-15]。正常組大鼠則給予等劑量PBS 溶液。造模成功后，Pic-L 治療組、Pic-H 治療組分別予5、10 mg/（kg·d）的Pic 灌胃，正常組、DCM 組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12 周。

1.4 常規(guī)超聲檢查評價大鼠心功能 藥物治療結(jié)束后，將各組大鼠吸入式麻醉，仰臥位固定，褪去前胸毛發(fā)，對大鼠進行常規(guī)超聲在體檢查，記錄左心室舒張末期直徑（LVIDd）、左心室后壁（LVPW）和左心室收縮率（LVFS）。

1.5 大鼠血糖以及心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比（HW/BW）檢測 將大鼠固定在固定器中，用刀片劃破大鼠尾尖，從尾根輕柔至尾尖，血液自然流出，采集至血糖試紙上，插入血糖儀檢測血糖。大鼠通過腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉安樂死，取出心臟稱重，計算HW/BW：大鼠的心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。

1.6 大鼠心肌組織SOD、MDA 水平 另取部分心肌組織，用生理鹽水洗凈后，濾紙吸干水分，將生理鹽水與組織以9∶1 的比例加入離心管中，用眼科小剪刀將組織剪成小碎片，然后用組織勻漿機制成10%心肌組織勻漿液，嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒操作說明書測定心肌組織SOD 和MDA 含量，評價各組大鼠的氧化應(yīng)激水平。

1.7 病理學(xué)評價 將大鼠心臟固定在4%的多聚甲醛中，石蠟包埋，制備成5 μm 切片，分別進行HE 染色觀察大鼠心肌形態(tài)與排列、天狼猩紅染色觀察大鼠心肌膠原沉積情況、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）免疫組化染色觀察心肌細胞炎癥情況，TUNEL 染色觀察心肌細胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 9 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett’s t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Pic 增強HG 環(huán)境下H9c2 心肌細胞活性 HG環(huán)境下的細胞活性比正常組細胞的活性下降，而給予Pic 培育24 h 后，細胞活性較HG 組增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在培育48 h 時，HG+Pic 組的細胞活性依舊高于HG 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 H9c2 細胞活性（%，±s）

表1 H9c2 細胞活性（%，±s）

注：正常組細胞培育在含有5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中；HG 組細胞培育在含有33 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中；HG+Pic 組細胞為培育在含有33 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中且給予0.01 mmol/L 白皮杉醇；與正常組比較，aP＜0.05；與HG 組比較，bP＜0.05

組別正常組HG 組HG+Pic 組24 h 100.00±9.54 81.33±6.03a 96.67±5.13 48 h 100.00±7.94 84.67±4.93a 102.00±5.57b

2.2 Pic 抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB 活化 通過免疫熒光染色評估在HG 誘導(dǎo)的H9c2 細胞中，NF-κB 激活的情況下發(fā)生p65 的核易位。在正常組中，p65 定位于細胞質(zhì)，在HG 條件下，NF-κB p65 核易位加速，p65 會定位于細胞核中，但給予Pic 處理后可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象，見圖1。

圖1 p65 免疫熒光染色（×600）

2.3 Pic 可改善DCM 大鼠心功能 與正常組比較，DCM 組大鼠的LVIDd 和LVFS 下降（P＜0.01），LVPW上升（P＜0.01）；與DCM 組比較，Pic-L 治療組和Pic-H 治療組的LVIDd 和LVFS 升高（P＜0.01），LVPW 下降（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標（±s）

表2 各組大鼠心功能指標（±s）

注：Pic-L 治療組大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；Pic-H 治療組大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；正常組和DCM 組灌胃同等劑量生理鹽水，連續(xù)灌胃12 周；DCM 為糖尿病心肌??；LVIDd 為左心室舒張末期直徑；LVFS 為左心室收縮率；LVPW 為左心室后壁；與正常組比較，aP＜0.01；與DCM 組比較，bP＜0.01

組別正常組DCM 組Pic-L 治療組Pic-H 治療組鼠數(shù)12 12 12 12 LVIDd（mm）7.11±0.13 5.64±0.13a 6.50±0.16b 7.41±0.09b LVFS（%）50.43±0.81 36.10±0.40a 44.83±1.36b 46.77±0.99b LVPW（mm）1.48±0.04 1.69±0.05a 1.59±0.05b 1.52±0.02b

2.4 Pic 改善DCM 大鼠血糖水平和HW/BW 值 與正常組比較，DCM 組大鼠的血糖和HW/BW 均升高（P＜0.01）；與DCM 組比較，Pic-L 治療組大鼠血糖下降（P＜0.01），HW/BW 比值有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Pic-H 治療組血糖和HW/BW 比值均降低（P＜0.01 或P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血糖與HW/BW 值（±s）

表3 各組大鼠血糖與HW/BW 值（±s）

注：Pic-L 治療組大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；Pic-H 治療組大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；正常組和DCM 組灌胃同等劑量生理鹽水，連續(xù)灌胃12 周；DCM 為糖尿病心肌?。慌c正常組比較，aP＜0.01；與DCM 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別正常組DCM 組Pic-L 治療組Pic-H 治療組鼠數(shù)12 12 12 12血糖（mmol/L）6.30±0.20 25.13±1.74a 19.47±1.21c 13.70±2.18c HW/BW（mg/g）2.60±0.36 5.20±0.46a 4.73±0.68 3.70±0.46b

2.5 Pic 抑制DCM 大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng) 與正常組大鼠比較，DCM 組大鼠SOD 下降（P＜0.01），MDA 上升（P＜0.01）。與DCM 組大鼠相比，Pic-L 治療組和Pic-H 治療組大鼠心臟組織SOD 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織SOD、MDA 水平（±s）

表4 各組大鼠心肌組織SOD、MDA 水平（±s）

注：Pic-L 治療組大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；Pic-H 治療組大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃12 周；正常組和DCM 組灌胃同等劑量生理鹽水，連續(xù)灌胃12 周；DCM 為糖尿病心肌?。籗OD 為超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛；與正常組比較，aP＜0.01；與DCM 組比較，bP＜0.01

組別正常組DCM 組Pic-L 治療組Pic-G 治療組鼠數(shù)12 12 12 12 SOD（U/mg protein）83.69±2.48 45.33±3.96a 59.41±1.98b 72.30±3.99b MDA（nmol/mg protein）3.11±0.12 5.05±0.26a 4.19±0.18b 3.55±0.13b

2.6 Pic 改善DCM 大鼠心肌纖維化 HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠的心肌細胞完整，且排列整齊、致密，無間質(zhì)水腫；而DCM 組大鼠的心肌細胞排列紊亂且形態(tài)變異，心肌纖維存在明顯的損傷和斷裂，且心肌細胞間隙增大。給予Pic 治療后，大鼠的心肌細胞排列較為完整、整齊，且心肌纖維的斷裂情況有所減輕。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，DCM 大鼠心肌膠原沉積現(xiàn)象明顯增加，心肌間質(zhì)存在纖維化，而給予Pic 治療后，能降低DCM 大鼠膠原沉積現(xiàn)象。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織染色（×200）

與正常組大鼠比較，DCM 組大鼠心臟切片中TGF-β1 表達上升；與DCM 組比較，Pic-L 治療組和Pic-H 治療組大鼠心臟切片中TGF-β1 表達下降。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織的TGF-β1 免疫組化染色（×200）

2.7 Pic 降低糖尿病誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡 與正常組大鼠比較，DCM 組心肌細胞凋亡加重；相較于DCM 組，Pic-L 治療組和Pic-H 治療組心肌細胞凋亡現(xiàn)象減輕。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織TUNEL 染色（×400）

3 討 論

DCM 的發(fā)生機制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細胞凋亡等多重病理生理過程，多種信號通路參與其發(fā)生過程。氧化應(yīng)激反應(yīng)以及促炎和細胞死亡途徑的激活，都會誘導(dǎo)DCM 的發(fā)生，引起細胞因子過表達和巨噬細胞浸潤誘導(dǎo)應(yīng)激、纖維化、細胞凋亡和器官損傷。因此，抗炎和抗氧化藥物可能有助于預(yù)防和治療DCM。

Pic 是具有抗炎和抗氧化活性的天然多酚化合物。為了探討Pic 對DCM 的治療效果及機制，本課題通過體內(nèi)外實驗進行驗證，首先我們驗證Pic 對H9c2 大鼠心肌細胞活性影響和抗炎效果，結(jié)果顯示，在HG 環(huán)境下，H9c2 細胞的活性有所抑制，而給予Pic 后，H9c2 的活性提高。此外主轉(zhuǎn)錄因子NFκB 調(diào)控HG 環(huán)境誘導(dǎo)的許多炎癥因子編碼基因的表達。HG 的刺激觸發(fā)了IκBα 的磷酸化，由此產(chǎn)生的p65 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，IκBα 隨后在細胞質(zhì)中降解。在細胞核中，NF-κB 激活編碼分解代謝酶、炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達[16]。本研究結(jié)果表明，在HG 條件下，NF-κB p65 核易位加速，p65 會定位于細胞核中，說明HG 條件激活了NF-κB，但給予Pic處理后可逆轉(zhuǎn)，說明Pic 在H9c2 細胞中的抗炎作用可能是通過抑制NF-κB 的激活來介導(dǎo)的。

許多研究表明，在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型[17-18]中存在心功能障礙。本研究首先通過心臟超聲檢查各組大鼠的心功能，大鼠腹腔注射STZ 建立Ⅰ型糖尿病模型后，能觀察到大鼠心臟收縮及舒張功能受損，與Ⅰ型糖尿病患者DCM 的癥狀相似，目前多用此方法制備DCM 模型大鼠，從本研究結(jié)果可知，DCM 組大鼠的LVIDd 和LVFS 較正常組大鼠降低，而LVPW 升高，說明DCM 組大鼠的心功能較正常大鼠有所受損，此外，給予Pic 干預(yù)治療的大鼠心功能較DCM 組大鼠有所改善。

TGF-β1 是心肌纖維化的關(guān)鍵因子，在DCM 心肌纖維化過程中處于過度表達狀態(tài)[19]。從HE 染色結(jié)果得知，Pic 治療能改善DCM 組大鼠心肌組織排列紊亂、心肌纖維斷裂的情況。且從TGF-β1 免疫組化染色的結(jié)果可以看到，Pic 治療后，TGF-β1 的表達較DCM 組降低，說明Pic 可通過下調(diào)TGF-β1 的表達來減少心肌纖維化。研究組還通過各組大鼠血糖水平和HW/BW 比值來檢測Pic 的治療作用，結(jié)果顯示，Pic 治療后的大鼠血糖和HW/BW 比值較DCM組大鼠下降，進一步證明Pic 可以預(yù)防與糖尿病相關(guān)的血糖水平的升高和心肌肥厚的發(fā)生。

氧化應(yīng)激仍被認為是DCM 發(fā)病的核心機制之一[20-21]，而Pic 具有抗氧化的作用，有文獻報道，Pic可以減輕糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激水平[22]，從研究結(jié)果可知，DCM 組大鼠心肌組織SOD 含量較正常組下降，同時MDA 含量升高，說明DCM 組大鼠心臟氧化應(yīng)激水平提高[23]，而給予Pic 治療后，氧化應(yīng)激反應(yīng)下降，同時，根據(jù)TUNEL 染色結(jié)果可知，Pic 治療后的大鼠心肌細胞凋亡水平下降，該結(jié)果說明Pic 通過提高心肌組織中SOD 水平和降低MDA 水平，來降低心肌細胞的凋亡，從而減輕DCM 的癥狀。

綜上，Pic 可能通過降低DCM 大鼠氧化應(yīng)激水平、減少心肌纖維化、改善心肌組織排列以及降低心肌細胞凋亡來預(yù)防和治療DCM。