miRNA和炎癥因子在早產(chǎn)孕婦血清中的表達及臨床意義

彭婷,張?zhí)煳?,黃素靜,鐘業(yè)騰,林明冠

早產(chǎn)是指妊娠滿28周至不滿37周的分娩,是產(chǎn)科常見的不良妊娠結(jié)局之一,其發(fā)生的原因和機制不明,妊娠維持和分娩啟動的異常均會導致早產(chǎn)的發(fā)生,全球每年約有1 300萬早產(chǎn)兒出生,占所有新生兒的9.6%,是引起新生兒近遠期并發(fā)癥和嬰兒死亡的主要原因[1-2],故早產(chǎn)不僅是嚴重的醫(yī)學問題,同時也是嚴重的公眾健康和社會問題。因此,了解早產(chǎn)發(fā)生過程中發(fā)揮關鍵作用的分子機制有助于臨床上采取相應措施預防早產(chǎn)發(fā)生。既往研究認為,由白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性因子參與的感染性炎癥反應是誘發(fā)孕婦早產(chǎn)的關鍵因素,但其具體的信號通路和分子調(diào)控機制仍未明確[3-7]。miRNA是由約22個非編碼的核苷酸組成的小分子以調(diào)節(jié)RNA,通過與相應的轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)合發(fā)揮其生物學效應,調(diào)控機體新陳代謝、增殖分化、生長凋亡等多種生理過程,同時miRNA也是機體重要的感染調(diào)控因子,炎性因子的活動離不開miRNA的參與,存在參與早產(chǎn)的理論基礎[8-10]。本研究旨在探討臨產(chǎn)前孕婦血清miRNA和炎性因子表達水平與早產(chǎn)的相關性,以期為臨床降低早產(chǎn)發(fā)生率,提高新生兒生存質(zhì)量提供依據(jù),也為后續(xù)早產(chǎn)機制研究提供新方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入2021年6月至2022年6月在海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)手術的98例孕婦作為研究對象,根據(jù)不同妊娠結(jié)局分為足月產(chǎn)組和早產(chǎn)組。納入標準:① 年齡20～35歲;② 孕周32～40周;③ 單胎妊娠。排除標準:① 伴有妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、妊娠期心臟病、妊娠期脂肪肝等合并癥的孕婦;② 因胎兒異?；蚧我a(chǎn)者;③ 因妊娠期合并癥治療性引產(chǎn)者;④ 有吸煙、酗酒等不良嗜好者;⑤ 雙胎妊娠。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有納入研究孕婦的臨床資料,包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)、文化程度、受孕方式、孕次、產(chǎn)次、孕周、有無胎膜早破等。

1.2.2 實驗室檢測 所有納入研究的孕婦臨產(chǎn)前取外周靜脈血標本2份,1份做miRNA生物芯片分析,先對血樣標本進行分離處理,獲得 RNA沉淀物,加入100%乙醇,混勻后離心過濾,提取miRNA,以miRNA-200、miRNA-199、miRNA-26b、miRNA-34b、miRNA-34c、miRNA-338為目標基因。生物分光光度計(紫外分光光度法)測定樣品OD值,熒光定量 PCR儀進行擴增,PCR反應采用10 μL反應體系,反應條件:95℃預變性15 min,然后 94℃變性 15 s、55℃退火 30 s 和 70℃延伸 30 s,共 45 個循環(huán)后反應結(jié)束,確認 Real-time PCR 的擴增曲線和融解曲線,進行 PCR 相對定量,其結(jié)果用 2-△△ct法計算目標基因的相對表達量。另1份靜脈血標本,采用酶聯(lián)免疫吸附法,測定血清炎癥因子TNF-α、IL-8、IL-6表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較

符合入組條件的孕婦平均年齡(27.3±3.5)歲,其中足月產(chǎn)組68例孕婦,年齡 25～32 歲,平均(26.8±3.3)歲,初產(chǎn)婦 40例,經(jīng)產(chǎn)婦 28例;早產(chǎn)組30例孕婦,年齡27～34 歲,平均(28.6±3.7)歲,初產(chǎn)婦16例,經(jīng)產(chǎn)婦14例,兩組孕婦文化程度、孕次、產(chǎn)次以及胎膜早破情況比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),年齡、體質(zhì)量指數(shù)等其他臨床因素比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見下頁表1。

表1 兩組一般臨床資料比較例(%)]

2.2 兩組臨產(chǎn)前血清炎癥因子水平比較

早產(chǎn)組孕婦臨產(chǎn)前血清TNF-α、IL-8以及IL-6表達水平明顯高于足月產(chǎn)組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見下頁表2。

表2 兩組臨產(chǎn)前血清炎癥因子水平比較

2.3 兩組臨產(chǎn)前血清miRNA比較

早產(chǎn)組孕婦臨產(chǎn)前血清miRNA-26b表達水平高于足月產(chǎn)組,血清miRNA-199表達水平低于足月產(chǎn)組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其他miRNA組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表3。

表3 兩組臨產(chǎn)前血清miRNA 比較

2.4 影響孕婦早產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

以孕婦不同妊娠結(jié)局作為因變量(足月產(chǎn)=0,早產(chǎn)=1),以單因素分析中有統(tǒng)計學意義的指標:文化程度(初中=1,高中=2,大學=3)、孕次(實際值)、產(chǎn)次(實際值)、胎膜早破(是=1,否=0)、TNF-α(實際值)、IL-8(實際值)、IL-6(實際值)、miRNA-26b(實際值)以及miRNA-199(實際值)作為自變量代入Logistic多因素模型進行分析,結(jié)果顯示:在調(diào)整和控制混雜變量后,胎膜早破、TNF-α、IL-6以及miRNA-26b為影響孕婦早產(chǎn)的獨立預測因素(P<0.05),詳見表4。

表4 影響孕婦早產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

2.5 ROC分析

以孕婦是否早產(chǎn)作為狀態(tài)變量,對TNF-α、IL-6以及miRNA-26b進行ROC分析,結(jié)果顯示,TNF-α、IL-6以及miRNA-26b對于孕婦早產(chǎn)均具有一定的預測價值(P<0.05),其中TNF-α預測孕婦早產(chǎn)的曲線下面積(AUC)為0.774(0.731～0.843),最佳診斷截點為55.1 ng/L,IL-6的AUC為0.821(0.764～0.941),最佳診斷截點為27.9 mg/L,miRNA-26b的AUC為0.852(0.821～0.935),最佳診斷截點為8.5×10-4,而聯(lián)合預測的價值最高,AUC為0.932(0.879～0.968),見圖1(彩插2)。

2.6 決策曲線分析

以TNF-α、IL-6以及miRNA-26b預測孕婦早產(chǎn)的凈收益率作為縱坐標,高風險閾值作為橫坐標,對3個獨立預測指標進行決策曲線分析,結(jié)果顯示,在實際閾值概率內(nèi),TNF-α、IL-6以及miRNA-26b預測孕婦早產(chǎn)均具有良好的凈收益率,并且聯(lián)合預測的凈收益率高于單一指標,見圖2(彩插2)。

3 討論

早產(chǎn)為妊娠期最常見的并發(fā)癥之一,其發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,據(jù)相關流行病學調(diào)查研究顯示,由早產(chǎn)引發(fā)的各個系統(tǒng)并發(fā)癥是新生兒死亡和低于 5 歲兒童死亡的最常見病因[11-12]。但目前關于早產(chǎn)的病因和發(fā)病機制尚未闡明,臨床上對于早產(chǎn)也缺乏及時有效的干預措施。

miRNA是由約22個非編碼的核苷酸組成的小分子調(diào)節(jié)RNA,通過與相應的轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)合發(fā)揮其生物學效應,調(diào)控機體新陳代謝、增殖分化、生長凋亡等多種生理過程,而且在惡性腫瘤、糖尿病、心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用,并且miRNA可以在血清和其他體液中穩(wěn)定存在,表達譜隨不同病理生理狀態(tài)而改變[13]。早產(chǎn)的主要特征為妊娠子宮由靜息至收縮表型轉(zhuǎn)化導致提前不可逆的產(chǎn)程發(fā)動,而miRNA 被認為是子宮平滑肌轉(zhuǎn)化過程中的重要調(diào)控分子。最近的研究表明,相較于足月產(chǎn)孕婦,早產(chǎn)孕婦血清中的確存在一系列異常表達的miRNA,在妊娠和分娩過程中,子宮肌層、子宮頸和胎膜均受到miRNA的調(diào)控和影響[14]。Ye等[15]研究發(fā)現(xiàn)P受體的下調(diào)表達導致轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào),誘導miRNA-199上調(diào),且子宮收縮相關基因CX43上調(diào)表達,導致分娩啟動。但是血清中與妊娠和分娩相關的 miRNA探索卻沒有獲得廣泛的關注,本研究發(fā)現(xiàn),miRNA-26b在早產(chǎn)孕婦血清中異常高表達,多因素Logistic回歸分析顯示,血清miRNA-26b為影響孕婦早產(chǎn)的獨立預測因素,并且隨著臨產(chǎn)前血清miRNA-26b表達水平升高,孕婦發(fā)生早產(chǎn)的風險也隨之升高,其可能原因為:miRNA-26b作為機體重要的炎癥和免疫調(diào)控因子,參與炎癥因子和趨化因子的表達調(diào)控,血清中miRNA-26b異常高表達促進分娩過程中炎癥因子向子宮平滑肌表達浸潤,導致子宮平滑肌功能異常和感染性早產(chǎn)發(fā)生。目前已有研究表明,miRNA-26b在敗血癥等感染性疾病患者血清中異常高表達,并且其血清表達水平與敗血癥患者住院期間死亡率呈正相關[16-17]。Xu等[18]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-26b通過調(diào)控相關炎癥因子及其合成產(chǎn)物,參與敗血癥等感染性疾病的發(fā)生發(fā)展以及疾病轉(zhuǎn)歸,但關于其與孕婦早產(chǎn)的相關性未見相關文獻報道,本研究結(jié)果提示,臨產(chǎn)前孕婦血清中miRNA-26b高表達可能導致子宮平滑肌功能異常和感染性早產(chǎn)發(fā)生,這有助于臨床深入認識早產(chǎn)發(fā)生的分子機制。

Contreras等[19]研究認為,多種炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α通過與相應的受體結(jié)合發(fā)揮其生物學效應,參與感染性早產(chǎn)的發(fā)生和分娩過程。Pinto等[20]研究發(fā)現(xiàn)子宮平滑肌組織中TNF-α表達上調(diào)與相應的受體結(jié)合可刺激上皮細胞和絨毛膜產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-1、3和前列腺素E2,引起胎膜破裂,宮縮發(fā)動。此外,分娩過程中IL-6表達上調(diào)并浸潤至子宮平滑肌組織,可刺激催產(chǎn)素受體表達,并通過激活丘腦-垂體-腎上腺軸增加前列腺素的產(chǎn)生。本研究通過比較足月產(chǎn)組和早產(chǎn)組臨產(chǎn)前的血清炎性因子表達水平發(fā)現(xiàn):早產(chǎn)組臨產(chǎn)前血清中TNF-α、IL-8、IL-6 表達水平均明顯高于足月產(chǎn)組,多因素Logistic回歸分析顯示,TNF-α、IL-6 為影響孕婦早產(chǎn)的獨立預測因素。其可能原因為:宮頸、宮內(nèi)感染以及炎癥反應是誘發(fā)早產(chǎn)的關鍵因素,而感染可引起TNF-α、IL-6 等炎癥因子的大量釋放,從而參與感染性早產(chǎn)的發(fā)生,但其具體調(diào)控機制仍需進一步的研究闡明。此外,本研究ROC分析和決策曲線分析顯示,TNF-α、IL-6、miRNA-26b作為孕婦早產(chǎn)的獨立預測因子均具有較高的預測效能和凈收益率,進一步證實了本研究結(jié)論。

綜上所述,TNF-α、IL-6以及miRNA-26b在早產(chǎn)孕婦血清中明顯高表達,三者用于預測孕婦早產(chǎn)具有較高價值,且聯(lián)合預測的預測效能和凈收益率最高。但本研究為樣本量較小的單中心研究,研究結(jié)果仍有待更多前瞻性大樣本多中心研究進一步驗證。