佛手瓜莖段組培快繁技術(shù)研究

王蘭蘭 李裕榮 陳之林 張朝君 杜致輝 文林宏

摘? ? 要：為建立佛手瓜完整的組培快繁體系，以佛手瓜莖段為外植體，探究外植體的最佳消毒條件；以篩選的MS為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.7%的瓊脂，探究不同的激素配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)、不定芽增殖和生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，佛手瓜莖段最佳消毒條件為75%酒精20 s + 0.1%氯化汞8 min；腋芽誘導(dǎo)適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，平均增殖系數(shù)達(dá)4.01，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA，生根率為93.33%，最適的瓶外扦插生根條件為0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min。研究建立的佛手瓜組培快繁體系，為優(yōu)質(zhì)佛手瓜種質(zhì)資源的保存提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：佛手瓜；組織培養(yǎng)；瓶外生根

中圖分類號(hào)：S652.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2023）09-030-06

Study on tissue culture and rapid propagation via stem section of Schium edule

WANG Lanlan1， LI Yurong1， 2， CHEN Zhilin1， 2， ZHANG Chaojun1， 2， DU Zhihui1， 2， WEN Linhong1， 2

（1.Horticulture Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2. Guizhou Horticulture Engineering Technology Research Center， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract： In order to establish a complete tissue culture and rapid propagation system of stem section of Schium edule as explants， exploring the best disinfection condition， MS was used as the basic medium， 3% sucrose and 0.7% agar are added to explore the effect of different hormone ratios on axillary bud induction， adventitious bud proliferation and rooting culture. The results showed that the best disinfection conditions for stem segment of Schium edule was 75% alcohol for 20 s + 0.1% HgCl2 for 8 min， The suitable medium for axillary bud induction was MS+1.0 g·L -1AC+1.0 mg·L -1 6-BA+0.1 mg·L -1 NAA and MS+1.0 g·L -1AC+1.0 mg·L -1 6-BA+0.1 mg·L -1IAA， the best proliferation medium was MS+0.1 mg·L -1 NAA+1.0 mg·L -1 6-BA， and the average proliferation coefficient could reach 4.01， and the best medium for rooting was 1/2MS+0.2 mg·L -1 NAA， and the rooting rate was 93.33%， the optimum conditions of ex vitro cutting rooting was 0.5 mg·L -1 NAA soaking for 30 min. The tissue culture and rapid propagation system of Schium edule established in this study provides a technical reference for the preservation of succulent germplasm resources.

Key words： Schium edule; Tissue culture; Ex vitro rooting

佛手瓜（Schium edule）為葫蘆科佛手瓜屬多年生植物，是重要的瓜類蔬菜之一，原產(chǎn)于西印度群島、中美洲及墨西哥，在19世紀(jì)初傳入中國(guó)，全國(guó)大部分地區(qū)均有種植，以貴州、云南、福建、廣東等地種植最多[1-2]。佛手瓜的果實(shí)富含維生素、胡蘿卜素、碳水化合物、脂肪等物質(zhì)成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-4]；此外，佛手瓜的提取物還有抗氧化、抗炎[5-7]、降血壓和調(diào)節(jié)血糖[8]等功效，具有較高的藥用價(jià)值。種植佛手瓜經(jīng)濟(jì)效益顯著，助推多數(shù)地區(qū)農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，例如貴州省惠水、紫云等地[9]，因此受到廣大農(nóng)戶和消費(fèi)者喜愛。

佛手瓜常用扦插法和整瓜育苗法繁殖。扦插法繁育的佛手瓜苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，整瓜育苗也存在一定的缺陷，通常是將整個(gè)瓜埋入土中，爛瓜率高，且每個(gè)瓜只含有1粒種子，種子和果皮緊密貼合不易分離，種子離瓜后無(wú)法發(fā)芽，存在繁殖率低、成本高及生長(zhǎng)過程中易受到病蟲害影響等問題，產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到限制[10-11]。因此，加大對(duì)佛手瓜育苗相關(guān)技術(shù)的研究力度，特別是對(duì)種質(zhì)資源的保存、新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新意義重大，而以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物技術(shù)在育苗方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的無(wú)病蟲害種苗。在瓜類蔬菜的相關(guān)研究過程中，建立高效的組織培養(yǎng)和再生體系是種質(zhì)資源保存和新品種選育成功的關(guān)鍵性基礎(chǔ)。近年來(lái)，組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在瓜類蔬菜中得到廣泛應(yīng)用，目前，多種瓜類蔬菜已經(jīng)能夠通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株，有的還建立了比較高效的再生體系[12]，但有關(guān)佛手瓜組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較少，因此，筆者以佛手瓜帶腋芽莖段作為外植體，建立高效快速的快繁體系，為后續(xù)佛手瓜種質(zhì)資源保存和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者以貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜保育大棚種植的優(yōu)良綠皮佛手瓜苗為試驗(yàn)材料，選取帶腋芽的莖段作為外植體。該品種收集自貴州省黔南布依族苗族自治州惠水縣好花紅鎮(zhèn)。試驗(yàn)于2021年11月至2022年7月在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

1.2.1 佛手瓜外植體的選取和消毒 選取長(zhǎng)勢(shì)良好的佛手瓜莖段作為外植體，剪成2 cm左右的1葉1節(jié)莖段，去除莖段葉片，加入洗潔精放置于流水下沖洗30～45 min，用軟毛刷刷掉表面殘留的灰塵，將沖洗后的莖段放入無(wú)菌超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒處理，采用75%酒精（10、20、30 s）進(jìn)行消毒，無(wú)菌水清洗3～5次，0.1%的氯化汞消毒（6、8、10 min），無(wú)菌水清洗5～6次，共計(jì)9個(gè)處理（表1），用無(wú)菌吸水紙吸掉莖段上多余的水分，接種至培養(yǎng)基中，放置于光照度2000 lx、溫度24 ℃、光照12 h條件下培養(yǎng)，每瓶接種3個(gè)帶腋芽莖段，每個(gè)處理接種20瓶，3次重復(fù)，15 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率和存活率。污染率/%=（污染外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)）×100，存活率/%=（存活的外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)）×100。

1.2.2 佛手瓜腋芽萌發(fā)誘導(dǎo) 將消毒處理后的佛手瓜莖段接種于5種不同的培養(yǎng)基（表2）上培養(yǎng)，放置于光照度2000 lx、溫度24 ℃、光照12 h條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理接種60個(gè)外植體，3次重復(fù)，15 d左右觀察腋芽萌發(fā)情況。腋芽出芽率/%=（萌發(fā)帶腋芽莖段數(shù)/總接種帶腋芽莖段數(shù)）×100。

1.2.3 佛手瓜繼代增殖培養(yǎng)基的篩選 將上一步誘導(dǎo)出的長(zhǎng)到3～5 cm的腋芽無(wú)菌苗切成帶有1葉1節(jié)的莖段，接種到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同激素質(zhì)量濃度6-BA（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0.01、0.1、0.2 mg·L-1）和IAA（0.01、0.1、0.2 mg·L-1）的培養(yǎng)基（表3）上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)，20 d后觀察并統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖情況。叢生芽增殖系數(shù)=萌發(fā)的叢生芽數(shù)/接種總外植體株數(shù)。

1.2.4 佛手瓜生根誘導(dǎo) 待腋芽長(zhǎng)到3～5 cm長(zhǎng)時(shí)，在無(wú)菌條件下切下腋芽轉(zhuǎn)接到不同激素濃度IBA或NAA的1/2MS生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種25個(gè)外植體，3次重復(fù)，15 d后觀察并統(tǒng)計(jì)植株生根情況（表4）。生根率/%=（生根組培苗數(shù)/接種組培苗數(shù)）×100；生根數(shù)=生根總條數(shù)/生根的外植體個(gè)數(shù)。

為建立佛手瓜瓶外生根繁育技術(shù)體系，采取另一種生根方法誘導(dǎo)生根。將3～5 cm長(zhǎng)度的腋芽切下作為瓶外生根材料，研究NAA不同質(zhì)量濃度（0.3、0.5、1.0 mg·L-1）和不同浸泡時(shí)間（30、60 min）對(duì)佛手瓜組培苗瓶外生根的影響情況（表5）。將腋芽切下浸泡處理后扦插到基質(zhì)中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種50個(gè)外植體，3次重復(fù)，15 d后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。扦插存活率/%=（扦插存活植株總數(shù)/總扦插植株數(shù)）×100。

1.2.5 佛手瓜煉苗和移栽 當(dāng)佛手瓜植株生根或者根系發(fā)育基本穩(wěn)定后，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至室外開蓋進(jìn)行煉苗2～3 d，接著將植株根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)土中，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。同時(shí)將穩(wěn)定后的佛手瓜瓶外生根扦插苗移栽至大棚中進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用Microsoft Excel 2010和SPSS 24進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)佛手瓜污染率和存活率的影響

在佛手瓜莖段的消毒處理中發(fā)現(xiàn)，選取佛手瓜莖段材料時(shí)，選擇莖粗較小且半木質(zhì)化的材料較為合適，不同的消毒方式對(duì)莖段的污染率和存活率有一定影響（表1），莖段的污染率隨著0.1%氯化汞浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，存活率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。其中利用75%酒精處理20 s、0.1%氯化汞處理8 min，存活率最高，達(dá)85.00%，污染率為10.56%。當(dāng)0.1%氯化汞處理時(shí)間為10 min時(shí)，污染率降低，但對(duì)莖段產(chǎn)生的傷害較大，存活率降低，因此選擇75%酒精處理20 s、0.1%氯化汞處理8 min作為佛手瓜莖段的最佳消毒方式。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)佛手瓜腋芽誘導(dǎo)的影響

將消毒好的佛手瓜莖段分別接種到不同的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)（表2），發(fā)現(xiàn)帶腋芽的佛手瓜莖段在3個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基上都能夠進(jìn)一步萌發(fā)和生長(zhǎng)，在添加了6-BA結(jié)合NAA或IAA的培養(yǎng)基上，腋芽的萌發(fā)速度較快，出芽率相當(dāng)，但是在基部易產(chǎn)生黃色松軟的愈傷組織且不能分化，影響腋芽的進(jìn)一步生長(zhǎng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與不添加活性炭（AC）的培養(yǎng)基相比，添加活性炭的培養(yǎng)基在佛手瓜基部產(chǎn)生的愈傷組織較少甚至不產(chǎn)生愈傷組織，葉色比較濃綠，莖稈粗壯、葉片大、節(jié)間短（圖1A～C），且MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA+1.0 g·L-1 AC和MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1 AC出芽率高，分別為91.11%、91.67%，與其他處理呈顯著差異；MS出芽率最低，僅為82.78%。因此選擇MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA+1.0 g·L-1 AC和MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1 AC作為佛手瓜腋芽誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3 不同激素處理對(duì)佛手瓜叢生芽增殖的影響

為了探究不同的激素處理對(duì)佛手瓜叢生芽增殖的影響，將誘導(dǎo)出的腋芽切下接種到不同激素處理的培養(yǎng)基中，合適的激素組合和濃度對(duì)芽的增殖培養(yǎng)有促進(jìn)作用（表3）。隨著6-BA質(zhì)量濃度從0.5 mg·L-1增加到2 mg·L-1，佛手瓜叢生芽增殖系數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中添加NAA的培養(yǎng)基叢生芽的增殖系數(shù)高于添加相同質(zhì)量濃度IAA的培養(yǎng)基，因此選擇NAA作為佛手瓜叢生芽增殖的誘導(dǎo)激素。在MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA培養(yǎng)基中，佛手瓜叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到4.01，植株長(zhǎng)勢(shì)最好，葉片嫩綠，植株也較高，表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖1-D）。隨著6-BA質(zhì)量濃度增加到2.0 mg·L-1，植株基部出現(xiàn)大量愈傷組織，在培養(yǎng)過程中逐漸褐化，且抑制植株的生長(zhǎng)和分化，增殖系數(shù)降低，因此選擇MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA作為佛手瓜叢生芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

2.4 不同激素處理對(duì)佛手瓜生根的影響

為了探究不同的激素處理對(duì)佛手瓜生根的影響，將長(zhǎng)到3～5 cm長(zhǎng)的佛手瓜苗切下，轉(zhuǎn)入到不同激素處理的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)10 d左右即可觀察到部分植株已經(jīng)開始生根，15 d左右部分植株的根系長(zhǎng)度可達(dá)3 cm，植株長(zhǎng)勢(shì)較好。從表4可以看出，選擇NAA和IBA作為添加劑進(jìn)行生根誘導(dǎo)，隨著濃度升高，生根率和生根條數(shù)都呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，NAA與IBA相比，前者的生根率高于后者，因此NAA作為添加劑更適合佛手瓜的生根誘導(dǎo)，在NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)生根率最高，達(dá)到93.33%，且生根條數(shù)也是最多的，平均生根數(shù)為6.67條，且在1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA條件下根粗而多、葉片大小中等、植株健壯、長(zhǎng)勢(shì)較好（圖1 E～F），因此選擇該培養(yǎng)基作為佛手瓜生根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.5 不同激素處理對(duì)佛手瓜瓶外扦插生根的影響

為建立佛手瓜瓶外生根繁育技術(shù)體系，探究一種方便和節(jié)約時(shí)間的生根方式，待佛手瓜腋芽長(zhǎng)到3～5 cm，直接將其剪下，采用激素浸泡處理后直接扦插。研究發(fā)現(xiàn)，NAA浸泡時(shí)間和濃度對(duì)佛手瓜扦插苗的存活率都有一定的影響，其中，浸泡60 min的存活率低于30 min（表5），在浸泡30 min條件下，存活率隨著NAA質(zhì)量濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在0.5 mg·L-1時(shí)存活率達(dá)到96.67%，與其他處理相比呈顯著差異，長(zhǎng)勢(shì)較好，10 d左右可以有新根長(zhǎng)出（圖1 G～H）。利用瓶外扦插有效避免了在瓶?jī)?nèi)生根后煉苗移栽對(duì)苗產(chǎn)生的損傷，因此選擇0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min作為最佳的佛手瓜瓶外扦插處理方式。

2.6 馴化移栽和管理

打開瓶蓋室溫?zé)捗? d后，將佛手瓜幼苗取出，用自來(lái)水將根部的培養(yǎng)基洗凈，將多余水分晾干后移栽至基質(zhì)中，進(jìn)行常規(guī)的水肥管理（圖1-I），存活率在95%以上。同時(shí)將生根后的佛手瓜瓶外扦插苗移栽至大棚中，進(jìn)行常規(guī)管理，長(zhǎng)勢(shì)良好。

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體材料的消毒是否成功是建立無(wú)性系的第一步，消毒不徹底會(huì)導(dǎo)致外植體細(xì)菌和真菌的滋生，進(jìn)而導(dǎo)致接種外植體死亡。佛手瓜莖段中空常常易殘留細(xì)菌，因此莖段的選取非常關(guān)鍵，經(jīng)過多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)選擇莖段較細(xì)且半木質(zhì)化的外植體消毒后存活率更高。在對(duì)佛手瓜的消毒方面，前人的研究常采用次氯酸鈉和氯化汞[10，13-14]，但是都未進(jìn)行系統(tǒng)的篩選，消毒效果未知。筆者的試驗(yàn)采用75%酒精20 s結(jié)合0.1%氯化汞8 min的消毒效果較好，存活率在85.00%以上。

佛手瓜的組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇也非常關(guān)鍵，前人的研究常用的外植體有幼葉、下胚軸及頂芽。趙建萍等[15]以佛手瓜幼葉為外植體誘導(dǎo)愈傷，但沒有進(jìn)行愈傷分化成芽的研究，王小素[16]以佛手瓜下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷分化成芽，但在后期的重復(fù)試驗(yàn)中未能成功分化，可能是由環(huán)境或者品種不同引起的，后期會(huì)繼續(xù)探索。筆者的研究采用帶腋芽莖段作為外植體，取材較容易且能夠保持親本遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，采用頂芽作為外植體時(shí)，消毒后褐化和死亡現(xiàn)象比較嚴(yán)重，這可能是因?yàn)轫斞坎糠植牧陷^嫩，消毒時(shí)間不易把控。

在佛手瓜的組培快繁過程中，腋芽誘導(dǎo)分化和叢生芽的增殖需要細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的共同作用，與6-BA、NAA和IAA的使用量密切相關(guān)。高濃度6-BA會(huì)使基部分化愈傷，但愈傷質(zhì)量較差，一段時(shí)間后直接褐化，且還會(huì)抑制腋芽的誘導(dǎo)。在植物的初代培養(yǎng)中，加入適量的活性炭可防止褐變、促進(jìn)新芽的形成和伸長(zhǎng)[17]，筆者的研究表明，添加一定濃度的活性炭會(huì)有效抑制愈傷組織的分化，促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)，這與前人的研究結(jié)果相似[18]。在佛手瓜的增殖培養(yǎng)階段，添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1 NAA都可以促進(jìn)佛手瓜叢生芽的增殖，但2種激素的比例與前人的報(bào)道不一致[13，19]，可能與植物內(nèi)源激素的含量有關(guān)。在生根階段，常選擇的激素有NAA、IBA和IAA等，其在瓶?jī)?nèi)或瓶外均有較好的生根誘導(dǎo)效果。瓶外生根有成本低、育苗周期短、簡(jiǎn)單易行等特點(diǎn)，在獲得無(wú)菌苗較多的情況下此方法可作為生根誘導(dǎo)的首選[20-21]。筆者研究了不同的激素濃度和浸泡時(shí)間對(duì)佛手瓜瓶外生根的影響，結(jié)果表明，以0.5 mg·L-1 NAA浸泡30 min佛手瓜的存活率最高且長(zhǎng)勢(shì)最好，利用此方法可節(jié)約成本和時(shí)間，縮短育苗周期，為佛手瓜的良種推廣提供參考。

筆者的研究結(jié)果表明，不同的消毒方式影響佛手瓜的污染率和存活率，佛手瓜莖段最佳消毒條件為75%酒精20 s + 0.1%氯化汞8 min；加入適量活性炭可有效抑制愈傷組織分化和促進(jìn)芽的形成伸長(zhǎng)，腋芽誘導(dǎo)適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA；NAA更適合佛手瓜的增殖培養(yǎng)，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，平均增殖系數(shù)可達(dá)4.01；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA，生根率為93.33%；最適的瓶外扦插生根條件為0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min。筆者建立的佛手瓜組培快繁體系為優(yōu)質(zhì)佛手瓜種質(zhì)資源的保存提供了技術(shù)參考。

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