井穴放血對腦缺血再灌注損傷作用機制的實驗研究進展

程旋,馬莉,彭雅莉,裴紅旭,耿帥,劉浩宇

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040)

卒中是中老年人常見的腦血管意外疾病,其中缺血性卒中占大多數(shù),有高致殘率、高死亡率等特點,發(fā)病時多伴有腦功能的損傷、意識障礙。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)急救措施具有狹窄的時間窗限制,急救時間緊迫且有諸多禁忌證。而井穴放血療法操作簡單,無不良反應(yīng),起效快速,早期介入治療對于卒中患者促醒、改善后遺癥和減輕病死率等方面具有重要的臨床意義[1]。此法作為卒中的中醫(yī)急救治療措施,有巨大的研究價值。

當(dāng)腦供血中斷時,因糖氧剝奪,數(shù)分鐘內(nèi)就會發(fā)生腦組織損傷和部分腦功能喪失[2],及時恢復(fù)缺血組織的血流,保證氧及能量的供應(yīng),對挽救半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞起到至關(guān)重要的作用。但在缺血一定時間后恢復(fù)血流供應(yīng),腦損傷程度不僅沒有恢復(fù)反而會進一步加重的現(xiàn)象稱腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia referfusion injury, CIRI),其病理損傷機制十分復(fù)雜,且不同的損傷機制和因素之間又相互交錯,相輔相成,構(gòu)成復(fù)雜信號網(wǎng),致使缺血腦組織發(fā)生瀑布級聯(lián)損傷。在急性中風(fēng)意識障礙的治療中,手十二井穴放血作為一種急救措施已被列為中醫(yī)臨床適宜技術(shù)在基層推廣應(yīng)用[3]。筆者在已有的實驗研究基礎(chǔ)上,歸納手十二井穴放血療法治療CIRI 的作用機制,現(xiàn)綜述如下。

1 井穴放血對離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)整作用

腦組織代謝旺盛對缺氧十分敏感,需要充足的血液灌注,提供腦對氧與營養(yǎng)物質(zhì)的需求,以維持正常的腦功能,急性腦缺血發(fā)生時首先出現(xiàn)能量代謝紊亂,線粒體結(jié)構(gòu)損傷,腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)合成減少,短時間內(nèi)能量被消耗殆盡,致使ATP 依懶性離子泵功能障礙,導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡,使鈉(Na)、鉀(K)、鈣(Ca)離子平衡被打破,細胞內(nèi)Na＋、Ca2＋濃度升高,細胞外K＋濃度升高,大量水分子流入細胞內(nèi),引起細胞毒性水腫。由于腦組織缺氧,影響線粒體呼吸鏈功能,無氧代謝產(chǎn)生大量乳酸,ATP的消耗又生成過量氫(H)離子堆積,缺血腦組織pH 降低,血管通透性增強,使細胞酸中毒,血管源性腦水腫。大量的H＋又能促使自由基的產(chǎn)生,加重腦應(yīng)激損傷。

1.1 對Na＋、K＋、H＋離子的調(diào)節(jié)作用,減輕腦水腫、細胞酸中毒

馬巖璠等[4]以大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠為實驗?zāi)Ｐ?觀察腦缺血后細胞外Na＋、K＋濃度變化情況及針刺后對其濃度的影響,結(jié)果觀察到缺血后的15 min 內(nèi)細胞外K＋濃度升高、Na＋濃度降低,針刺組細胞外Na＋、K＋濃度變化幅度較凝結(jié)組小,表明手十二井穴放血能抑制腦缺血組織細胞外Na＋內(nèi)流、K＋升高,從而減輕腦水腫。何樹權(quán)等[5]以MCAO 大鼠為動物模型,觀察缺血后手十二井放血對H＋濃度的影響,結(jié)果針刺組H＋升高幅度在缺血后5～8 min 較模型組低,說明井穴放血對缺血組織升高的H＋有一時性的抑制作用,從而減輕了細胞酸中毒。但隨著缺血時間延長,抑制作用則不明顯。

1.2 對Ca2＋超載的抑制作用,緩解Ca 損傷

因腦組織缺血、缺氧,ATP 被快速消耗,能量代謝障礙引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng),引起離子穩(wěn)態(tài)失衡,大量Ca2＋流入細胞內(nèi),形成Ca2＋超載,細胞膜去極化,大量興奮性氨基酸(excitatory amino acids, EAA)被合成釋放,激活 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-Daspartic acid receptor, NMDA)受體,促使Ca 通道打開,加重Ca2＋超載[6]。Ca2＋超載與EAA 的釋放相互協(xié)同[7-8],形成惡性循環(huán)。Ca2＋超載還參與自由基、一氧化氮(nitric oxide, NO)對腦組織的損傷過程。Ca2＋超載對腦組織的損傷主要見于,Ca2＋超載可激活各種降解酶,損傷細胞結(jié)構(gòu),破壞神經(jīng)元骨架,使核酸解體;激活一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS),使NO 合成增加,加重腦細胞毒性作用;生物膜磷脂被降解生成大量自由基和其他降解產(chǎn)物,自由基可導(dǎo)致膜的脂質(zhì)過氧化,其他降解產(chǎn)物可使白細胞聚集和血管痙攣、收縮,進而形成微血栓,加重腦缺血;破壞血腦屏障,使其通透性增加,加重腦水腫;使線粒體氧化磷酸化失偶聯(lián),影響細胞呼吸[9-11]。以阻斷大鼠大腦中動脈造成腦缺血的實驗?zāi)Ｐ?采用Ca2＋選擇性針型塑料電極,監(jiān)測胞外Ca2＋活度[12],結(jié)果觀察到針刺組細胞外Ca2＋濃度下降趨勢減弱,井穴放血可阻止缺血腦細胞Ca2＋內(nèi)流,減輕Ca2＋超載,起到神經(jīng)細胞保護的作用。腦缺血的大鼠在針刺后8 min 起,細胞外Ca2＋內(nèi)流就開始被有效抑制,至20 min 時,Ca2＋超載情況已有所緩解[13]。井穴放血可以抑制缺血后的Ca2＋超載,減輕其對腦組織的損傷。井穴放血可降低腦缺血大鼠升高的鈣調(diào)素(calmodulin, CaM)的含量,與Ca2﹢結(jié)合復(fù)合物,使去甲腎上腺素、5-羥色胺釋放,引起血管痙攣,加重腦缺血[14]。降低細胞內(nèi)CaM 濃度可間接保護腦。

2 降低興奮性氨基酸的毒性作用

腦缺血再灌注時,大量氧自由基增多、鈣離子紊亂,神經(jīng)元細胞膜發(fā)生快速去極化,突觸前的EAA(主要是谷氨酸)合成釋放增加,因能量代謝障礙,ATP 合成不足,EAA 的攝取減少,導(dǎo)致谷氨酸聚集,對神經(jīng)系統(tǒng)造成興奮毒性作用[15]。大量的谷氨酸作用于NMDA 受體,進而激活了Ca2＋通道,加重Ca2＋損傷[16];谷氨酸與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體結(jié)合,引起Ca2＋通道開放,繼發(fā)水分子內(nèi)流,導(dǎo)致腦水腫。過量的谷氨酸還可以激活磷酯酰肌醇信號通路,改變細胞膜的通透性,引起細胞毒性水腫,同時可介導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生,NO 的合成,加重腦損傷。缺血腦組織的興奮性氨基酸的濃度上升,給予刺血后,興奮性氨基酸濃度下降趨勢比凝結(jié)組有顯著差異;表明手十二井穴放血可降低EAA 濃度,減輕EAA 對腦組織的興奮性毒性[17]。

3 拮抗氧化應(yīng)激,減弱自由基損傷

腦組織內(nèi)富含不飽和脂肪酸,抗氧化能力弱。當(dāng)恢復(fù)血流和供氧后,機體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增多,不能被超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)和谷胱甘肽完全消除,使大量的自由基堆積,氧化還原平衡被打破,活性氧簇發(fā)生蓄積,進而產(chǎn)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng),對腦組織造成嚴重損傷。自由基損傷主要為過量的氧自由基會降解細胞內(nèi)大分子物質(zhì),使細胞結(jié)構(gòu)功能受損;可引起膜的脂質(zhì)過氧化,磷脂被降解而變性失能;使線粒體結(jié)構(gòu)破壞,呼吸功能及ATP 的合成障礙,溶酶體裂解,細胞發(fā)生自溶;促使基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的釋放,損傷內(nèi)皮基底層細胞,破壞血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)。自由基還介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等病理機制。NOS 是NO 生物合成的關(guān)鍵酶,不同類型的NOS 合成的NO 作用不同,NO 對缺血組織具有保護和損傷雙重作用。神經(jīng)元型、誘導(dǎo)型NOS 參與腦組織損傷的過程。腦缺血的急性期神經(jīng)元型NOS 產(chǎn)生過量的NO,以自由基形式對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性,在缺血后期,誘導(dǎo)性NOS 活性增強,NO 合成增加,過量的NO 可破壞BBB。NO 與超氧陰離子結(jié)合形成亞硝酸鹽,因具有很強的毒性可損傷線粒體膜,使DNA 氧化,最終導(dǎo)致細胞凋亡。

予腦缺血實驗大鼠手十二井放血治療,可降低腦組織中因缺血而致病理性增高的NO濃度,減輕NO對腦組織的神經(jīng)毒性作用,緩解腦損傷[18]。急性腦缺血實驗性大鼠每日予井穴放血治療,3 d 后測得NOS 活性明顯降低;說明井穴放血可以降低NOS 的活性,進而抑制NO的合成,減輕腦組織神經(jīng)毒性[19]。SOD 具有清除自由基、防止過氧化的作用,是機體內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要酶之一。通過MCAO 實驗大鼠予十二井穴放血后,觀察腦內(nèi)SOD 的活性及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)的含量變化情況[20],結(jié)果證明井穴放血可能通過增加SOD 的活性,提高了機體清除自由基的能力,降低體內(nèi)自由基的含量,減輕自由基對腦細胞的損傷過程。

4 減輕炎癥級聯(lián)損傷

炎癥反應(yīng)是機體遇到壞死組織的一種正常免疫應(yīng)答,促炎和抗炎反應(yīng)之間存在著動態(tài)平衡,使機體發(fā)揮對壞死組織的清除作用。腦組織缺血、缺氧時,能量耗竭,中心壞死區(qū)誘導(dǎo)白細胞發(fā)生浸潤過程[21],產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)及炎癥細胞因子,如白細胞介素[白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6) 和 白 細 胞 介 素 -10(interleukin-10, IL-10)] 、 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等,引發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng),缺血再灌注后,進入缺血組織新鮮血液中的中性粒細胞、炎癥趨化因子又釋放出更多的炎癥介質(zhì)[22],進一步加重炎癥反應(yīng);Ca2＋超載及EAA 興奮性毒性使大量細胞凋亡,激活星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞釋放具有神經(jīng)毒性促炎介質(zhì),破壞血腦屏障,造成腦水腫。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1, TGF-β1)可拮抗炎癥細胞因子的表達,進而減輕炎癥反應(yīng)。針刺十二井穴可促進腦缺血組織神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞TGF-β1 的表達,進而發(fā)揮腦保護的功能[23]。TNF-α是一種促炎性細胞因子,在腦缺血急性期TNF-α的表達異常增加,誘導(dǎo)促進炎癥反應(yīng)和血栓形成。馬惠芳等[24]實驗研究證明針刺井穴可有效抑制TNF-α的表達,降低TNF-α含量,減輕炎癥反應(yīng)帶來的腦損傷。石會[25]發(fā)現(xiàn)井穴放血可降低中風(fēng)患者血清中TNF-α及IL-6 表達水平,證明了井穴放血可減輕中風(fēng)后炎癥反應(yīng),有助于臨床癥狀的恢復(fù)。

5 抑制神經(jīng)元細胞凋亡

在腦缺血再灌注中,半暗帶區(qū)細胞死亡以細胞凋亡為主,韓江全等[26]總結(jié)了3 種細胞凋亡的途徑,線粒體途徑,主要分兩方面,其一是破壞呼吸鏈,使線粒體跨膜電位崩解,呼吸鏈解藕聯(lián),使凋亡誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)出,最終使細胞凋亡;其二是促凋亡因子通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被大量釋放,誘導(dǎo)細胞凋亡。通過細胞外信號途徑介導(dǎo)細胞凋亡。過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡。腦損傷時大量自由基可激活TRPM7 通道,引起級聯(lián)反應(yīng),最終也可導(dǎo)致細胞凋亡[27]。有研究表明腦缺血再灌注后細胞凋亡與自由基有關(guān)[28]。

腦缺血后的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素可破壞端粒使其縮短[29],誘導(dǎo)P53 基因表達,進而激活線粒體凋亡通路,使細胞發(fā)生水腫、凋亡[30]。張旭等[31]以腦梗死小鼠為實驗?zāi)Ｐ?觀察小鼠的端粒長度變化及相關(guān)基因表達情況,實驗結(jié)果表明給予小鼠手十二井穴放血可以延長其端粒長度,進一步升高TRET、TRF1 和TRF2基因表達水平,促進端粒的生物合成,抑制細胞凋亡,減輕腦水腫及神經(jīng)功能缺損癥狀。早反應(yīng)基因c-fos與熱休克蛋白HSP70 共同參與缺血后腦損傷的修復(fù)與重建過程,對細胞凋亡起決定性的作用。王秀云等[32]研究發(fā)現(xiàn)在急性腦缺血的大鼠腦組織中c-fos 基因和應(yīng)激HSP70 蛋白表達增加,以抵抗細胞凋亡,早期給予井穴放血后缺血區(qū)c-fos 和HSP70 的表達水平進一步增加,表明盡早給予井穴放血治療可延緩急性腦缺血大鼠神經(jīng)細胞的凋亡進程,增強腦保護的作用。

6 對其他方面的影響

有研究[33-34]發(fā)現(xiàn),井穴放血可減輕腦缺血大鼠的腦水腫損傷,其效果與甘露醇的療效相當(dāng)。王艷等[35]實驗研究表明,井穴放血可能通過促進線粒體生物合成,提供了能量供應(yīng),減輕腦水腫,改善神經(jīng)功能損傷,起到腦保護作用。陳宇岑等[36]發(fā)現(xiàn)手十二井放血可降低腦缺血大鼠的血腦屏障的通透性,從而保護了BBB,減輕腦損傷。張秀花等[37]實驗證明早期給予井穴放血可減小大鼠腦組織梗死體積,緩解神經(jīng)功能缺損癥狀。黃雅倩等[38]觀察到井穴放血可增加高原缺氧大鼠血清中低氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長因子含量,促進海馬組織Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白的表達,進一步證明了對高原缺氧腦損傷的大鼠井穴放血可提高腦組織缺氧耐受能力,具有明顯的抗缺氧作用,另一方面激活線粒體自噬,減少自由基損傷,起到腦保護作用。姜小秋等[39]研究發(fā)現(xiàn)給予健康大鼠井穴放血治療,可以延長大腦的耐缺氧時間,且不同井穴之間具有相對特異性。馬巖番等[40]實驗亦表明手十二井穴放血可減緩腦缺血大鼠氧分壓下降趨勢,抑制了低氧狀態(tài)發(fā)展,起到腦保護作用。

7 討論

井穴為經(jīng)脈之氣的起始部位,又為陰陽經(jīng)交接的地方,根據(jù)“根結(jié)、標(biāo)本”理論、經(jīng)絡(luò)循行,井穴可作為腦部病變治療的關(guān)鍵穴位,井穴放血可起到祛瘀瀉熱、通經(jīng)接氣、交通陰陽、醒腦開竅的作用,切中中風(fēng)病病機。井穴放血可能是通過改變了局部微循環(huán)的血流動力學(xué)的原因,產(chǎn)生的剪切力影響內(nèi)皮細胞功能蛋白的表達,進而影響腦缺血的病理機制[41-42]。將井穴放血的起效機制歸納為“感、效、傳”3 個部分[43],“感”是井穴接受針刺刺激并將其信號轉(zhuǎn)換的啟動過程,相當(dāng)于西醫(yī)的“感受器”;“傳”是針刺信號的響應(yīng)和傳導(dǎo),通過軀體神經(jīng)和交感神經(jīng)傳入;“效”為相關(guān)因子及其功能通路的應(yīng)答。早期研究[44]發(fā)現(xiàn)只有放血、疼痛和腧穴共同作用于機體,才會起到應(yīng)有的療效,改變?nèi)魏我粋€因素均會減弱其效果,提出手十二井穴放血可簡化為井穴放血,且以腦組織病變側(cè)刺絡(luò)效果好。

總結(jié)以上井穴放血對各種病理生理機制的影響,概括其主要是通過緩解腦水腫、修復(fù)血腦屏障、抑制細胞凋亡等而起到腦保護的作用。現(xiàn)對于急性腦缺血患者最有效的急救措施是溶栓療法,但具有明顯的時間限制,多數(shù)患者入院時已錯過時間窗,故臨床醫(yī)生也更多關(guān)注后遺癥的治療,對中風(fēng)初起患者中醫(yī)急救治療臨床研究甚少,井穴放血從多方面影響其病理環(huán)節(jié)對缺血性卒中的治療是多途徑、多機制、多療效的,其操作簡單、安全性高,作為中風(fēng)急救的治療具有重要的臨床研究的價值,下一步希望可以深入開展相關(guān)的高質(zhì)量的臨床研究,為中醫(yī)急救體系的建立添磚加瓦。