油茶葉多酚的提取及其對(duì)常見植物病原真菌抑制作用研究

謝水香,雷彩燕

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州 450002

油茶(Camelliaoleifera)是山茶科(Theaceae Mirb),山茶屬(CamelliaL.)的一種多年生常綠灌木。油茶中含有大量的活性物質(zhì),比如多酚、角鯊烯、黃酮以及微量元素等[1]。目前人們對(duì)油茶的開發(fā)和利用主要集中在油茶籽和油茶籽油[2],而油茶的葉子則成了廢料。

多酚(polyphenol)是指分子結(jié)構(gòu)中具有若干個(gè)酚羥基的化合物的總稱,在植物的根、莖、葉以及果實(shí)中都有廣泛的分布。多酚主要的衍生物是兒茶素類(catechins),還含有酚酸類(phenolic acids)、黃烷醇類(flavanols)等物質(zhì)。多酚作為一類植物次生代謝產(chǎn)物,是植物抵御病原菌入侵的重要生化物質(zhì)之一。目前關(guān)于茶多酚對(duì)動(dòng)物細(xì)菌的抑菌活性研究較多,而且已經(jīng)得到普遍公認(rèn)[3, 4]。而對(duì)于油茶多酚的研究,大多數(shù)僅僅是山茶籽油中多酚的提取及含量測(cè)定[5,6],關(guān)于其抑菌活性的研究相對(duì)缺乏。因此,本研究對(duì)油茶葉多酚進(jìn)行提取,研究其對(duì)植物病原真菌的抑制活性及機(jī)理,為植物源農(nóng)藥的開發(fā)以及病害的綠色防控提供基礎(chǔ)。研究有利于拓寬油茶資源的綜合開發(fā)利用以及多酚在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[7]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所用油茶葉均采自江西省贛州市興國縣興江鄉(xiāng)江口村的油茶樹。

供試植物病原菌包括:假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)[8]、新月彎孢霉(Curvularialunata)[9]、鏈格孢(Alternariaalternata)[10]、草莓多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)[11]、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)[12]、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[13]、尖孢鐮孢菌苦瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.momdicae)[14]。

病原菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室純化,在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上倒置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度28 ℃,光照和黑暗培養(yǎng)各12 h,純化兩代以上。

酒石酸亞鐵溶液、磷酸鹽緩沖液:根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚測(cè)定方法(GBT8313-2002),制作酒石酸亞鐵溶液和磷酸鹽緩沖液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚的提取

將采摘好的油茶葉用水清洗干凈,然后放置工作臺(tái)瀝干,在60 ℃下烘干至恒重,用高速離心粉碎機(jī)研磨成粉,過60目篩后置于密閉環(huán)境,低溫、遮光保存[15]。參考文獻(xiàn)[16,17]的方法進(jìn)行多酚提取,提取溫度為40 ℃,超聲波功率為300 W,液料比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40,乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%,超聲波時(shí)間為20、40、60、80 min,每個(gè)提取條件重復(fù)4次。浸提完,離心(4 ℃,3 000 r/min),取上清液進(jìn)行多酚含量測(cè)定。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚測(cè)定方法(GBT8313-2002),使用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,在540 nm波長處,采用0.5 cm比色皿測(cè)定上清液吸光度。根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定多酚質(zhì)量,按照公式(1)計(jì)算多酚提取率。

(1)

式中:C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的樣品質(zhì)量濃度,g/mL;V為樣品溶液的體積,mL;L為樣品的總稀釋倍數(shù);m為樣品的質(zhì)量,g。

1.2.2β-環(huán)糊精對(duì)多酚的保護(hù)作用

按照“1.2.1”的方法,在1.0 g油茶葉粉末中添加不同質(zhì)量β-環(huán)糊精(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g),提取和測(cè)定多酚提取率并研究β-環(huán)糊精對(duì)其影響[18, 19],每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.3 多酚的分離純化

采用文獻(xiàn)[20,21]的方法進(jìn)行多酚樣品的分離純化。離心后的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3,加入等體積氯仿,振蕩萃取;取上層液體;加入等體積的乙酸乙酯萃取上層液體,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干,多酚固體用去離子水溶解,利用凍干儀得到精制的多酚樣品[22]。

1.2.4 多酚對(duì)植物病原真菌抑制效果研究

參考文獻(xiàn)[23,24]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。供試植物病原真菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng),待菌株即將長滿平板后,轉(zhuǎn)板繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至長滿整個(gè)平板后備用。在溫度為40～50 ℃的PDA培養(yǎng)基中,加入多酚溶液混勻,制成有效濃度為10%、5%、2%、0%的多酚PDA培養(yǎng)基。用內(nèi)徑9 mm的打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅置于平板中央,放入培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。從第三天開始,采用十字交叉法測(cè)定各菌株的菌落直徑(D),待空白對(duì)照組長滿整個(gè)平板后停止測(cè)量,按照公式(2)計(jì)算多酚的抑菌率。

抑菌率=

(2)

1.2.5 多酚對(duì)植物病原真菌菌落形態(tài)的影響

方法步驟與“1.2.4”一致,當(dāng)空白對(duì)照組即將長滿整個(gè)平板時(shí),使用相機(jī)拍攝處理組與對(duì)照組的菌落,比較各菌落顏色及形態(tài)。

1.2.6 多酚對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

用打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅放在50 mL的PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(28 ℃,160 r/min),對(duì)照組PDB培養(yǎng)基中放入空白PDA餅塊。菌液開始渾濁后,吸取0.2 mL原液,在顯微鏡下觀察孢子數(shù)量。待PDB培養(yǎng)液中孢子量滿足實(shí)驗(yàn)要求,過濾得到孢子懸浮液,在生物顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板法統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量,按照公式(3)、(4)計(jì)算數(shù)據(jù)。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

孢子量=孢子平均數(shù)×500

(3)

抑制率=

(4)

采用凹玻片計(jì)數(shù)法[25]觀察孢子萌發(fā)情況。在培養(yǎng)皿上面鋪一層濕潤的濾紙,每個(gè)凹玻片中打入60 μL的孢子懸浮液后,將凹玻片放在濾紙上面,隨即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度28 ℃,光照∶黑暗 = 12∶12),每隔2 h在生物顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況,按照公式(5)、(6)計(jì)算數(shù)據(jù)[26]。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

(5)

抑制率=

(6)

1.2.7 油茶多酚對(duì)病原真菌可溶性蛋白含量的影響

用打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅放入多酚有效濃度為10%的PDB培養(yǎng)基中,對(duì)照組為放入空白PDA餅塊的PDB培養(yǎng)基,28 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌液開始渾濁后,在超凈工作臺(tái)過濾得到處理組原液和對(duì)照組原液。分別吸取0.01 mL對(duì)照組和處理組上清液于離心管中,隨即加入0.09 mL的蒸餾水以及0.50 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合。室溫下靜置2 min后比色,并記錄吸光值(OD595)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出空白對(duì)照組和多酚處理組的可溶性蛋白含量[27]。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用WPS office Excel、GraphPad Prism 8.0整理數(shù)據(jù)和繪圖,利用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析,采用單因素ANOVA檢驗(yàn),事后比較采用Bonferroni、Tamhane分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取條件的優(yōu)化

目前人們對(duì)油茶葉的利用率較低,對(duì)油茶葉多酚的研究更少,不同的提取條件影響多酚的提取率[15,28,29]。為了提高油茶葉中多酚的提取率,分析了不同料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間下的提取率變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖1)看出,多酚的最佳提取方案為1∶30 g/mL的料液比,60%的乙醇濃度以及60 min的超聲波時(shí)間,多酚提取率達(dá)14.10%。

圖1 料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間和β-環(huán)糊精添加量對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Solid-liquid ratio,ethanol concentration,ultrasonic time and addition amount of β-cyclodextrin on the extraction rate of polyphenols注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different letters indicate significant differences (P <0.05).

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多酚提取過程中,在多酚的最佳提取方案中加入0.80 g的β-環(huán)糊精,多酚提取率可提升至22.92%。添加β-環(huán)糊精可以提高多酚的提取率,這與前人報(bào)道相一致,即β-環(huán)糊精可以和多酚形成超分子復(fù)合物,可保護(hù)多酚,避免多酚降解[19,30],從而提高多酚的提取率,但是否影響多酚對(duì)植物病原菌的抑制作用尚未可知,還需進(jìn)一步研究。

2.2 多酚對(duì)常見植物病原真菌抑菌率的影響

從結(jié)果(見表1)看出多酚對(duì)不同病原真菌的抑菌率不同,濃度越高,抑菌作用越明顯。有效濃度為10%的多酚對(duì)假禾谷鐮刀菌、新月彎孢霉、鏈格孢、草莓多主棒孢霉、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌的抑菌率達(dá)到50%以上;有效濃度為5%的多酚對(duì)假禾谷鐮刀菌、新月彎孢霉、草莓多主棒孢、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌的抑菌率達(dá)到40%以上;有效濃度為2%的多酚對(duì)草莓多主棒孢、大麗輪枝菌、尖孢鐮孢菌苦瓜專化型的抑菌率達(dá)到30%以上。

表1 多酚對(duì)植物病原真菌生長速率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)可知,多酚的抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前文獻(xiàn)報(bào)道一致,即多酚提取物對(duì)植物病原菌具有一定的抑制作用,且多酚對(duì)不同病原菌的抑菌效果會(huì)隨著多酚有效濃度的增加而增加。

2.3 多酚抑菌機(jī)理研究

2.3.1 多酚對(duì)常見植物病原真菌菌落的影響

在研究多酚對(duì)常見植物病原真菌的抑菌作用時(shí),發(fā)現(xiàn)處理組的菌落顏色發(fā)生變化,因此拍攝了植物病原真菌的菌落。結(jié)果(見圖2)顯示,經(jīng)多酚處理后的菌落顏色和形態(tài)都發(fā)生變化,其中有效濃度為10%的差異最為明顯,5%的有效濃度也有較明顯差異。

圖2 多酚對(duì)菌落形態(tài)的影響Fig.2 Effect of polyphenols on colony morphology注:CK:對(duì)照組;10%:多酚有效濃度為10%的處理組;5%:多酚有效濃度為5%的處理組;A:葡萄座腔菌;B:鏈格孢;C:假禾谷鐮刀菌;D:大麗輪枝菌;E:新月彎孢霉;F:草莓多主棒孢霉;G:尖孢鐮孢菌苦瓜?；汀ote:CK:control group;10%:polyphenol with effective concentration of 10% of treatment group;5%:polyphenol with effective concentration of 5% of treatment group;A:Botryosphaeria dothidea;B:Alternaria alternata;C:Fusarium pseudograminearum;D:Verticillium dahlia;E:Curvularia lunata;F:Corynespora cassiicola;G:Fusarium oxysporum f.sp.momdicae.

2.3.2 多酚對(duì)常見植物病原真菌孢子數(shù)量、萌發(fā)以及形態(tài)的影響

多酚處理后,菌落顏色和形態(tài)發(fā)生了改變,為了進(jìn)一步探究多酚抑制常見植物病原真菌的機(jī)理,以抑菌效果最強(qiáng)的植病原真菌-大麗輪枝菌為研究對(duì)象,用有效濃度為10%的多酚對(duì)大麗輪枝菌進(jìn)行培養(yǎng),觀察植物病原真菌的產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)情況。結(jié)果顯示,多酚處理后,大麗輪枝菌的孢子抑制率達(dá)97.79%,孢子萌發(fā)抑制率達(dá)81.77%,說明多酚對(duì)大麗輪枝菌孢子量和孢子萌發(fā)都具有抑制作用。

在探究多酚對(duì)植物病原真菌孢子量以及萌發(fā)是否有影響時(shí),發(fā)現(xiàn)經(jīng)多酚處理后的植物病原真菌孢子形態(tài)發(fā)生變化(見圖3)。光學(xué)顯微鏡下可見孢子形態(tài)呈現(xiàn)畸形,孢子變細(xì)、產(chǎn)生芽管,且在孢子一端或兩端聚集許多顆?；蛐∏虻痊F(xiàn)象;而對(duì)照組孢子粗細(xì)均勻且無膨大等情況,如圖3所示。文獻(xiàn)報(bào)道多酚影響病原菌的菌絲形態(tài)、孢子數(shù)量,例如紅豆皮多酚提取物處理李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028后,能夠觀察到菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的褶皺和凹陷;烏藥葉多酚處理金黃色葡萄球菌后,可以觀察到細(xì)胞變形、皺縮和塌陷等現(xiàn)象[32];茶多酚處理玉米小斑病菌、香蕉炭疽病菌和蓮腐敗病菌后,能夠抑制三種病原菌的孢子萌發(fā),并且觀察到孢子產(chǎn)生芽管以及在孢子的端部聚集了許多顆粒或小球,菌絲則扭曲、畸形[33],與本研究結(jié)果推測(cè)的多酚抑菌機(jī)理一致。

圖3 大麗輪枝菌對(duì)照組與處理組孢子形態(tài)對(duì)比Fig.3 Comparison of spore morphology between control group and treatment group of Verticillium dahlia注:CK:對(duì)照組;10%:多酚有效濃度為10%的處理組。Note:CK:control group;10%:treatment with polyphenol of 10% effective concentration.

2.3.3 多酚對(duì)常見植物病原真菌可溶性蛋白含量的影響

選擇有效濃度為10%的多酚處理后抑菌率在50%以上的病原真菌進(jìn)行培養(yǎng),研究多酚對(duì)植物病原菌可溶性蛋白含量的影響。從結(jié)果(見表2)可以看出,經(jīng)過10%的多酚處理后的病原真菌可溶性蛋白含量從高到低依次為:新月彎孢霉>葡萄座腔菌>草莓多主棒孢霉>大麗輪枝菌>假禾谷鐮刀菌>鏈格孢,其中新月彎孢霉的可溶性蛋白增量最高,處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量約為空白對(duì)照組的5 443.00倍。經(jīng)多酚處理后,新月彎孢霉、草莓多主棒孢霉、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌和假禾谷鐮刀菌的可溶性蛋白含量增加,而鏈格孢可溶性蛋白含量減少。

表2 多酚對(duì)植物病原真菌可溶性蛋白含量的影響

在研究茶葉中的茶多酚對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的過程中,發(fā)現(xiàn)茶多酚阻礙了蛋白質(zhì)的正常表達(dá),影響了酶的催化活性及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成,導(dǎo)致細(xì)菌喪失正常的生理活性[34,35]。前人研究及本文的研究均表明,多酚對(duì)多種植物病原真菌具有不同程度的抑制作用,多酚對(duì)不同病原真菌的抑制效果存在很大的差異,這可能與病原真菌本身的生物學(xué)特性有關(guān)。對(duì)植物病原真菌進(jìn)行多酚處理后,可溶性蛋白質(zhì)含量增加,可能是多酚提取物破壞了細(xì)胞膜的通透性,菌落顏色改變、菌絲形態(tài)畸形和孢子原生質(zhì)外溢的現(xiàn)象能夠支持上述假設(shè);也可能是病原真菌對(duì)化學(xué)脅迫做出的一種自我適應(yīng)和調(diào)節(jié)方式,當(dāng)這種脅迫超過植物病原真菌自身的一定極限時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致病原真菌病變或死亡。然而鏈格孢可溶性蛋白含量減少這一現(xiàn)象的出現(xiàn),對(duì)其作用機(jī)理還未知,需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

油茶葉多酚提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,料液比、乙醇濃度和超聲波時(shí)間對(duì)多酚的提取影響較大,應(yīng)用β-環(huán)糊精能夠提高多酚的提取率。β-環(huán)糊精輔助提取油茶葉多酚的最優(yōu)工藝條件為:料液比為1∶30、乙醇濃度60%、超聲波時(shí)間為60 min、β-環(huán)糊精添加量為0.80 g,該條件下多酚物質(zhì)的提取率為22.92%,該研究結(jié)果可為β-環(huán)糊精輔助提取油茶葉多酚提供理論基礎(chǔ)和參考。本研究表明多酚提取物能夠抑制常見植物病原真菌的生長和孢子的形成與萌發(fā),改變菌絲形態(tài)和菌落顏色,以及改變病原真菌細(xì)胞膜的通透性,這為抗真菌新藥、轉(zhuǎn)基因抗病植物的研發(fā)提供了新選擇。