LMCD1在結直腸癌組織中的表達及意義

趙晨蕊,何成彥,嵇如月,方 玲

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130033)

結直腸癌(CRC)是全球最普遍和最致命的實體惡性腫瘤之一[1],也是全球癌癥相關死亡的第二大常見原因,終生風險約為4%至5%[2]。CRC的發(fā)病率和死亡率正在迅速增加[3]。本實驗通過二維色譜質譜聯(lián)用技術和免疫印跡探究大鼠LIM半胱氨酸豐富域蛋白1(LMCD1)在癌組織和癌旁組織中的差異表達及意義,報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入向吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標本庫申請的經病理學診斷為結直腸腺癌的新鮮組織標本共24例,術前所有患者均未做任何治療。所采用的癌旁組織取自同一患者距離癌組織10 cm以上的部位。獲取的標本經預冷液體沖洗后,進行液氮速凍并放入-80℃冰箱保存以便日后使用。

1.2 主要儀器與試劑

TPCK修飾的測序級胰酶,高效液相色譜儀,NH4HNO3,DTT,LTQXL 離子阱質譜儀、反向毛細管色譜分析柱,LMCD1單抗,β-actin多抗,BCA定量試劑盒,碘代乙酰胺。

1.3 方法

1.3.1樣本蛋白提取及濃度測定 取出-80℃保存的組織樣本,在充分研磨后加入提前配制的裂解液并置于冰上半小時,在去除樣本中殘留DNA和RNA后,14 000 rpm,4℃的條件下離心10 min,吸出上清液并參考BCA蛋白定量試劑盒上的說明書在96孔板內進行加樣,于562 nm處進行吸光度測定,根據(jù)繪制的標準曲線計算出各個樣本蛋白濃度。

1.3.2樣本蛋白多肽混合物的制備 取出凍存樣本,放至室溫下數(shù)分鐘待其達到平衡后,加入適當量的NH4HNO3和DTT稀釋使樣本調整濃度為20 mmol/L,避光56℃放置1 h,待反應完全并冷卻至室溫后加入適當量的IAM使終濃度為50 mmol/L,避光反應0.5 h。按照蛋白與胰酶的比例是50∶1的條件下加入胰酶并將其在37℃水浴箱中培養(yǎng)過夜,所得物放于-80℃冰箱中以待備用。

1.3.3二維色譜質譜聯(lián)用技術分析 將上述所得物經0.1%的FA溶解后分別對應每組樣本取50 μg用于色譜上樣,而通過色譜洗脫分離后的蛋白多肽樣本經LTQXL離子阱質譜儀的分析后,篩選一定核質比范圍最后得到LC/MS圖譜。

1.3.4免疫印跡試驗 對目的蛋白LMCD1在癌組織及癌旁組織中的差異表達進行檢測,對LC/MS圖譜的結果進行驗證。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯(lián)用技術分析結果

本實驗通過圖譜數(shù)差異來衡量癌組織和癌旁組織中同一蛋白的豐度,滿足條件為蛋白圖譜數(shù)比值≥1且蛋白圖譜數(shù)差值≥72,根據(jù)以上的標準,檢測到ADRM1、TOMM34、MCM4等18個上調蛋白,HSPB1、CNN1、CKB等15個下調蛋白,通過文獻查閱以及生信分析,選取LMCD1作為目的蛋白,且為上調蛋白,質譜圖結果見圖1。

圖1 LMCD1質譜圖

2.2 免疫印跡試驗結果

LMCD1蛋白差異驗證見圖2,其在癌組織中蛋白表達量明顯高于癌旁組織。

圖2 LMCD1蛋白免疫印跡試驗結果

3 討論

CRC是男性和女性中第二大常見癌癥,約占全球所有新癌癥病例的10%,因其致命危險性使得死亡率快速上升[4],因此未來還需要研究更多的新型標志物和靶點。

LMCD1是LIM蛋白家族的成員,由一個N端富含半胱氨酸的結構域、一個中央PET(Prickle、Espinas和Testin)結構域和兩個C-終端LIM結構域組成[5],而且這些結構域通常都會參與蛋白質-蛋白質相互作用[6]。作為細胞調節(jié)機制的重要組成部分,學者們對LIM蛋白已經做了大量的相關研究,但對LMCD1的細胞學功能研究卻很少[7]。SURESH GOVATATI等[8]研究發(fā)現(xiàn)LMCD1通過增強NFTAc1和E2F1啟動子的活性,參與HASMC(人主動脈平滑肌細胞)中凝血酶誘導的IL-33的表達和遷移,首次揭示了IL-33是HASMC遷移和損傷時產生的新內膜所必需的物質。朱斌等[9]通過體內外功能研究結果表明LMCD1是一種新的成骨分化調節(jié)因子,可能是骨代謝相關疾病的潛在治療靶點,與對照組相比,LMCD1的下調明顯抑制了骨髓干細胞的成骨分化而增強了成脂分化,LMCD1的上調促進了成骨分化而抑制了脂肪形成分化。也有研究結果表明LMCD1突變可以通過Rac1信號通路促進細胞遷移,是HCC(肝細胞癌)轉移中潛在的致癌標志物[10]。TCGA分析表明,肝癌組織中LMCD1-AS1(LMCD1反義RNA)的表達水平高于癌旁組織,其表達升高與預后不良有關,敲低和過表達LMLCD1-AS1可以相應地改變let-7g的表達水平進而干擾其靶基因P4HA2在肝癌細胞中的表達[11]。除此之外,LMCD1-AS1還可作為miR-106b-5p的ceRNA促進骨肉瘤的發(fā)展,影響其存活率[12]。其他學者研究表明E2F1可以直接與LMCD1-AS1的啟動子區(qū)域結合并激活其轉錄,阻礙膽管癌細胞(CCA)的增殖和侵襲,誘導癌細胞的凋亡,E2F1/LMCD1-AS1/miR-345-5p/COL6A3軸在膽管癌腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮作用,為CCA提供潛在的治療靶點[13]。

本實驗通過LC-MS和Westen blot技術對蛋白在結直腸癌中的差異表達進行了分析驗證,確定了LMCD1在結直腸癌中高表達,這可能成為結直腸癌診斷和篩查中的一個新的潛在生物靶點,后續(xù)還需要下一步的實驗探索。