宏基因組二代測(cè)序在感染性疾病精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

胡麗玲,楊曉云,鄭 紡

(天津市人民醫(yī)院 特殊檢查實(shí)驗(yàn)室,天津中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,天津300121)

感染性疾病(infectious disease)是由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱,目前仍然是全球公共衛(wèi)生重大威脅,傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法已不能滿足臨床診斷和治療的需要[1]。與傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法(培養(yǎng)、質(zhì)譜法、免疫相關(guān)抗原抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)技術(shù)等)比較,宏基因組學(xué)的二代測(cè)序(mNGS)是一種非靶向廣譜病原學(xué)篩查技術(shù),近幾年發(fā)展迅猛已廣泛應(yīng)用于感染性疾病病原微生物的精準(zhǔn)診斷,特別是在危重、疑難、罕見、新發(fā)病原體導(dǎo)致感染的診斷。

1 宏基因組二代測(cè)序概況

宏基因組學(xué)的臨床應(yīng)用起源于2000年初微陣列技術(shù)的應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)早期的一些成功應(yīng)用包括SARS冠狀病毒的發(fā)現(xiàn)、癌癥突變的基因圖譜,以及對(duì)人體不同部位微生物組的深入分析[2]。宏基因組二代測(cè)序無需預(yù)設(shè)、無需培養(yǎng)、無偏好性,通過提取臨床樣本中DNA或RNA片段,直接對(duì)樣本中所有核酸進(jìn)行高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)庫比對(duì)和智能化算法分析,能夠快速、準(zhǔn)確的判斷致病病原微生物的種類(包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等)。此外,mNGS檢測(cè)可以覆蓋全樣本類型包括腦脊液、體液、膿液、拭子、肺泡灌洗液、組織、痰液、血液等,而且可顯著提高低病原含量無菌體液樣本的陽性率。mNGS主要操作流程包括:樣本的采集與處理、提取核酸、文庫構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、信息分析、報(bào)告解讀;其一次可測(cè)得上萬種病原體,可檢測(cè)新發(fā)、罕見、跨物種傳播、混合感染病原體以及培養(yǎng)陰性的病原體,尤其適用于疑難、危重、特殊感染性疾病的診斷[2-3]。

2014年,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報(bào)道了1例14歲男孩患有聯(lián)合免疫缺陷重癥腦膜腦炎,應(yīng)用傳統(tǒng)的多項(xiàng)病原檢測(cè)技術(shù)均未能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致感染的病原體,隨后患兒腦脊液mNGS檢測(cè)診斷為鉤端螺旋體感染,開啟了全世界對(duì)mNGS的關(guān)注[4]。MIAO等[5]對(duì)511例臨床樣本研究發(fā)現(xiàn)mNGS對(duì)感染性疾病診斷的敏感性高于培養(yǎng)(50.7%vs 35.2%),針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、病毒、厭氧菌、諾卡菌和真菌的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)也非常明顯,而且受先前抗生素暴露的影響較小,是一種很有前途的傳染病檢測(cè)技術(shù)。多項(xiàng)臨床研究表明mNGS在感染性疾病診斷研究中非常有潛力,如確診博卡病毒[6],鸚鵡衣原體[7]、水痘帶狀皰疹病毒[8]、細(xì)小單胞菌[9]、阿米巴腦膜炎[10]、裂頭蚴病感染[11]等。最值得關(guān)注的是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19,mNGS 技術(shù)能夠檢測(cè)到樣本中所有的病毒基因序列,從而識(shí)別出新型病毒,還能夠通過比對(duì)基因序列找到變異位點(diǎn),協(xié)助尋找中間宿主及病毒起源[12]。

2 mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷的應(yīng)用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病主要包括腦炎、腦膜炎以及脊髓炎等,具有高發(fā)病率和病死率的特點(diǎn),快速準(zhǔn)確的檢出病原菌,給予患者及時(shí)有效的診療對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義。傳統(tǒng)的診斷流程很大程度上依賴于病原體特異性檢測(cè),有時(shí)還需要侵入性外科手術(shù),且需要數(shù)天到數(shù)周的時(shí)間。近幾年,應(yīng)用mNGS輔助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病越來越受到重視,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的精準(zhǔn)治療中發(fā)揮重要作用。

WILSON等[13]進(jìn)行的大樣本、多中心前瞻性研究,共納入美國(guó)8家醫(yī)院204例兒科和成人患者,調(diào)查了腦脊液mNGS檢測(cè)對(duì)感染性腦膜炎和腦炎的診斷價(jià)值。該研究發(fā)現(xiàn)13例(22%)僅由mNGS 確診的病例中7例(54%)幫助臨床啟動(dòng)治療,6例通過mNGS進(jìn)行了耐藥基因、病毒分型、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、進(jìn)化分析等深入分析。由mNGS和常規(guī)檢查共同確診的19例,通過mNGS檢測(cè)到多種病原體如:圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、戊型肝炎病毒、EB病毒、無乳鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、法氏諾卡氏菌、熱帶假絲酵母菌、克雷伯菌屬產(chǎn)氣桿菌、米特斯鏈球菌、糞腸球菌、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和新型隱球菌等。一項(xiàng)單中心、前瞻性隊(duì)列研究表明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的細(xì)菌性感染中無論采用何種抗菌藥物治療mNGS均優(yōu)于培養(yǎng)法和其他常規(guī)方法;接受經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療的患者用常規(guī)方法檢出率顯著降低約20%,而mNGs檢出率不受影響;在培養(yǎng)陰性患者中,mNGS額外檢測(cè)出48種細(xì)菌和真菌[14]。另有結(jié)核性腦膜炎(TBM)患者相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腦脊液標(biāo)本mNGS診斷結(jié)核分枝桿菌的敏感性可達(dá)84.4%,明顯高于抗酸桿菌(AFB)、BACTECTM MGIT 960培養(yǎng)(MGIT 960)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Xpert MTB/RIF檢測(cè)的診斷性能,與T-SPOT相比未顯示出明顯優(yōu)勢(shì),但兩者結(jié)合在一起可彌補(bǔ)臨床常規(guī)檢測(cè)的不足,最大化提升腦脊液結(jié)核桿菌的檢出率[15-16]。PIANTADOSI等[17]對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者進(jìn)行腦脊液RNA和DNA的mNGS分析,檢測(cè)到蜱傳播的病原體波瓦桑病毒、伯氏疏螺旋體和嗜吞噬細(xì)胞無形體,還發(fā)現(xiàn)了地理相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,如新英格蘭的蜱媒感染。

3 mNGS在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中病原學(xué)診斷的應(yīng)用

3.1 肺部感染病原體的診斷

呼吸系統(tǒng)感染是造成全球死亡人數(shù)最多的一類感染,下呼吸道感染(LRTIs)發(fā)病率和病死率在成人和兒童中位居第4位,2019年死亡人數(shù)達(dá)260萬[18]。近年來分子生物學(xué)方法在感染性疾病病原檢測(cè)中表現(xiàn)突出,如DNA限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)等,但仍有50%左右的呼吸系統(tǒng)感染無法明確病原體[19]。mNGS 可大大提高呼吸系統(tǒng)感染病原體診斷效率,也是mNGS應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。借助mNGS檢測(cè)可以獲得肺部病原體微生物組的概況,其在病原體檢測(cè)中提供了足夠的準(zhǔn)確性和更高的靈敏度,能夠輔助重癥肺炎診斷,尤其是應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以觀察的病原體[20]。

QIAN等[21]對(duì)100例肺部感染患者的呼吸道樣本進(jìn)行了常規(guī)方法和mNGS檢測(cè),該研究顯示mNGS對(duì)病原菌和真菌的檢測(cè)靈敏度高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(95%vs54%,P<0.001);mNGS診斷病毒感染的敏感性低于PCR,但它發(fā)現(xiàn)了14種常規(guī)方法無法檢測(cè)到的病毒,包括多種亞型的人類皰疹病毒;mNGS檢測(cè)對(duì)病毒基因組覆蓋率>95%,為流行病學(xué)研究提供了可靠的信息。該研究建議當(dāng)臨床懷疑存在混合或罕見病原體感染時(shí),尤其是在免疫功能低下和(或)需要緊急治療的病情危重的患者,應(yīng)及時(shí)使用mNGS。CHEN等[22]對(duì)235例疑似肺部感染患者采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本,應(yīng)用mNGS和微生物培養(yǎng)技術(shù)評(píng)價(jià)其對(duì)肺部感染的診斷價(jià)值。該研究表明BAL標(biāo)本的mNGS檢測(cè)可為肺部感染性疾病提供更準(zhǔn)確的診斷信息,mNGS在描述多微生物生態(tài)系統(tǒng)、展示不同基礎(chǔ)疾病患者呼吸道微生物分布和優(yōu)勢(shì)菌株方面比微生物培養(yǎng)更有優(yōu)勢(shì)。BAL的mNGS對(duì)肺部感染病原體的診斷敏感性為88.89%,特異性為14.86%,陽性預(yù)測(cè)值(PPV)為21.16%,陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為83.87%。單純肺部感染患者和免疫功能低下患者中感染類型以細(xì)菌感染(58.33%)和混合感染(43.18%)為主。LIU等[23]研究還發(fā)現(xiàn)mNGS對(duì)經(jīng)支氣管鏡肺活檢(TBLB)標(biāo)本病原微生物測(cè)序的敏感性優(yōu)于肺泡灌洗液,而與肺泡灌洗液相比其特異性降低;mNGS對(duì)肺組織中病原菌的檢測(cè)尤其是肺部難治性感染性疾病具有較高診斷價(jià)值,包括巨細(xì)胞病毒肺炎、吉氏肺囊蟲肺炎(PCP)、肺曲霉病和肺結(jié)核;此外,mNGS還協(xié)助診斷非感染性肺部并發(fā)癥如移植物抗宿主病(GVHD)、特發(fā)性肺炎綜合征(IPS)和遲發(fā)性肺毒性綜合征(DPTS)。CHEN等[24]研究還在1名27歲的男性患者會(huì)厭組織和氣管肺泡灌洗液(BALF) 通過mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了組織胞漿菌,而會(huì)厭組織和肺病理均未見陽性結(jié)果。

3.2 協(xié)助診斷社區(qū)獲得性肺炎

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是威脅嬰幼兒及老年人群健康的常見感染性疾病,mNGS還可以協(xié)助診斷免疫缺陷患者社區(qū)獲得性肺炎[25-26]。有研究應(yīng)用mNGS對(duì)121例社區(qū)獲得性肺炎患兒的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測(cè),mNGS的診斷性能陽性符合率為86.78%(105/121),高于常規(guī)方法(培養(yǎng)和靶向聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn))陽性符合率為66.94%(81/121)的診斷性能;使用mNGS 與常規(guī)方法聯(lián)合檢測(cè)診斷的患者比例增加到99.18%;其中僅mNGS確診的患者占17.36%;肺炎鏈球菌占52.38%,合并感染占23.8%;此外,僅用mNGS檢測(cè)到百日咳博德氏菌和人博卡病毒(HBoV)[27]。

3.3 病毒及厭氧菌的診斷

RNA病毒在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中占有重要地位,在檢測(cè)呼吸道RNA病毒方面mNGS也優(yōu)于RT-PCR和多重PCR,對(duì)于不排除病毒感染的患者進(jìn)行mNGS檢測(cè)時(shí),可同時(shí)進(jìn)行DNA及RNA檢測(cè)。有研究應(yīng)用RNA mNGS評(píng)估SARS-CoV-2 RT- PCR陰性中的替代病毒感染頻率和SARS-CoV-2 RT-PCR陽性中的病毒復(fù)合感染頻率,mNGS鑒定了常規(guī)臨床檢查檢測(cè)到的所有病毒(甲型流感病毒、人偏肺病毒、人冠狀病毒OC43、人冠病毒HKU1);mNGS還發(fā)現(xiàn)了常規(guī)臨床檢查未檢測(cè)到的吸道合胞病毒(RSV)、人類偏肺病毒(hMPV)、人類冠狀病毒NL63等[28]。mNGS檢測(cè)與qRT-PCR能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),可最大化的實(shí)現(xiàn)各自的臨床診斷價(jià)值。張文宏團(tuán)隊(duì)首次結(jié)合qRT-PCR、CRISPR和mNGS對(duì)首個(gè)COVID-19輸入性病例進(jìn)行了快速診斷[29]。此外,mNGS技術(shù)對(duì)呼吸系統(tǒng)厭氧菌感染的精準(zhǔn)化診斷方面具有優(yōu)勢(shì),厭氧菌感染的病原體檢出的陽性率為71.43%(10/14)顯著高于培養(yǎng)的陽性率7.14%(1/14)(P<0.01)[30]。

呼吸系統(tǒng)與外界相通,正常菌群微生物組成復(fù)雜,大量條件致病菌與感染菌的鑒別困難。不同呼吸系統(tǒng)感染類型優(yōu)選標(biāo)本類型也不同,不同的標(biāo)本類型檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)不盡相同,為進(jìn)一步保障mNGS結(jié)果準(zhǔn)確性,國(guó)內(nèi)已發(fā)表多個(gè)專家共識(shí)[31-33]。

4 mNGS在血液系統(tǒng)感染性疾病病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

血流感染病原體隨著血流播散至全身各組織器官,除了能夠?qū)M織器官造成直接損傷外,還能夠引起內(nèi)分泌、代謝、凝血、免疫炎癥反應(yīng)的異常,最終導(dǎo)致膿毒癥、感染性休克及多器官功能障礙[2]。血流感染控制不佳導(dǎo)致的膿毒癥甚至感染性休克,是危重患者死亡的重要原因。全球每年報(bào)告的膿毒癥發(fā)病人數(shù)為1940萬,與膿毒癥相關(guān)的死亡人數(shù)為530萬[34]。血流感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是血培養(yǎng)(Blood Culture),然而傳統(tǒng)血培養(yǎng)的陽性率低于20%,至少需要3～5天,對(duì)于特定的細(xì)菌培養(yǎng)物、結(jié)核分枝桿菌和真菌則需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間;對(duì)諾卡氏菌、隱球菌、布魯氏菌陽性率較低,病毒無法培養(yǎng)[35]。

有研究顯示在血流感染發(fā)作前幾天,mNGS通過血液中游離細(xì)胞DNA(mcfDNA)序列可以識(shí)別出與臨床相關(guān)的病原體,從而可能實(shí)現(xiàn)提前干預(yù)治療。mcfDNA-seq對(duì)所有血流感染的預(yù)測(cè)敏感性為75%(95%可信區(qū)間為51%～90%),對(duì)細(xì)菌性BSI的敏感性為80%(95%置信區(qū)間為55%～93%)[36]。GRUMAZ等[37]從48名膿毒癥患者的256份連續(xù)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿樣本中,分離出mcfDNA,在整個(gè)研究期間血培養(yǎng)陽性率僅為11%,而mNGS陽性率為71%;急性膿毒癥患者中mNGS陽性率為96%,根據(jù)專家評(píng)估其中53%的病例更換或給予更充分的治療。斯坦福大學(xué)急診醫(yī)學(xué)中心對(duì)納入的350例膿毒癥患者比較了mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在膿毒癥患者中的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示mNGS診斷膿毒癥病原體的敏感性92.9%,特異性62.7%;其陽性率顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率(48.6%vs18.1%),mNGS平均檢測(cè)時(shí)間為29小時(shí)[38]。另有研究納入124例ICU重癥膿毒癥患者,不僅發(fā)現(xiàn)mNGS檢測(cè)病原體陽性率明顯高于傳統(tǒng)血培養(yǎng),還發(fā)現(xiàn)1例肺孢子蟲、1例結(jié)核病原體及罕見的吉羅維肺孢子蟲[39]。國(guó)內(nèi)林威等[40]研究報(bào)道應(yīng)用mNGS檢測(cè)協(xié)助診斷3例無焦痂兒童恙蟲病,而傳統(tǒng)檢測(cè)方法未能確診病原。血液mcfDNA mNGS檢測(cè)不僅可用于診斷血流感染,還可用于診斷深部感染或難以取樣的部位感染 (如侵襲性真菌感染、 肺炎或骨髓炎)[41]。

5 mNGS在其他感染性疾病中病原學(xué)診斷的應(yīng)用

mNGS技術(shù)在其他系統(tǒng)感染性疾病的診療中也有較高的診斷價(jià)值。殷楚強(qiáng)等[42]研究表明mNGS對(duì)疑似脊柱感染患者的診斷與臨床最終診斷一致性較好,mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)常見化膿性脊柱炎的病原微生物為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌;其他常見感染類型為脊柱結(jié)核、布魯桿菌脊柱炎,還發(fā)現(xiàn)了脆弱擬桿菌、微小微單胞菌、齒垢密螺旋體、貝納柯克斯體等少見病原微生物。LI等[43]研究證實(shí)應(yīng)用mNGS從福爾馬林固定角膜標(biāo)本中可檢測(cè)出大多數(shù)感染性角膜炎患者的真菌、細(xì)菌和阿米巴病原體,還發(fā)現(xiàn)了其他潛在病原體如巨細(xì)胞病毒。mNGS在消化系統(tǒng)感染中的應(yīng)用也有研究,例如1例發(fā)熱和腹痛的患者應(yīng)用mNGS能夠快速診斷馬爾尼菲籃狀菌感染[44]。此外,mNGS是免疫缺陷患者中如腫瘤、器官移植患者病原學(xué)診斷的很好的補(bǔ)充,尤其適用于器官移植后、免疫缺陷和長(zhǎng)期使用免疫抑制劑患者的嚴(yán)重感染。如快速精準(zhǔn)診斷免疫缺陷病人卡氏肺孢子蟲感染[45]。

6 總結(jié)

綜上,mNGS技術(shù)是傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的補(bǔ)充和延伸,能夠快速、客觀檢測(cè)出臨床樣本中的多種病原微生物,在感染性疾病精準(zhǔn)診斷中顯示出巨大臨床應(yīng)用價(jià)值。盡管有越來越多的關(guān)于mNGS成功的報(bào)道,但短期內(nèi)仍無法完全取代傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法,有一些技術(shù)瓶頸需要解決,如mNGS檢測(cè)的大量序列屬于宿主,可能導(dǎo)致病原體序列比例低,影響病原體檢測(cè)的敏感性。從呼吸道、口腔和生殖道采集的標(biāo)本中,很難區(qū)分正常定植菌和致病菌。病原體基因數(shù)據(jù)庫制備缺乏統(tǒng)一、全面、準(zhǔn)確的參照數(shù)據(jù)庫;對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和厚壁微生物的檢出率較低。由于基因型與表型不一致,點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥、毒力變化難以檢測(cè),暫時(shí)無法滿足病原體耐藥及毒力分析。對(duì)于感染性疾病患者病原體的判定需要依賴于報(bào)告解讀者對(duì)于mNGS檢測(cè)、醫(yī)學(xué)微生物、感染病學(xué)知識(shí)有所積累的經(jīng)驗(yàn),臨床醫(yī)師對(duì)待mNGS檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)踐綜合判斷。隨著測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)以及更多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和評(píng)估,未來mNGS將朝著臨床應(yīng)用規(guī)范化、規(guī)模化、精細(xì)化、自動(dòng)化方向發(fā)展,助力感染性疾病精準(zhǔn)診斷。