電針對應(yīng)激性潰瘍小鼠十二指腸黏膜內(nèi)CD4、CD8、SIgA 及炎癥因子表達的影響

陳 琳，邱淵銘，趙 洋，陽晶晶，曹思慧，何灝龍，楊宗保，常小榮，劉 瓊*，劉 密*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102

應(yīng)激性潰瘍是臨床常見胃腸疾病之一，其主要臨床特征以胃和十二指腸黏膜的潰瘍、糜爛為主，且病程后期病變部位多集中于十二指腸部[1]。 隨著社會的快速發(fā)展，人們的壓力日益增大，加上環(huán)境污染、飲食作息不規(guī)律等社會問題，使人們長期處于有害的應(yīng)激狀態(tài)之中，致使胃腸潰瘍的患病率逐年攀升[2]。 目前，臨床上多選用克拉霉素、甲硝唑、奧美拉唑、西咪替丁及鹽酸度洛西汀等藥物聯(lián)合應(yīng)用為主[3]，但藥物的長期使用容易引發(fā)多種不良反應(yīng)[4-5]。

針灸作為我國傳統(tǒng)的外治療法之一，被廣泛應(yīng)用于胃腸病的治療中，與藥物治療相比具有綠色、便捷及毒副作用小等優(yōu)勢[6-9]。 既往研究表明，針刺可有效調(diào)節(jié)消化性潰瘍大鼠胃腸組織的炎癥因子水平，減輕腸道炎癥，改善胃腸黏膜損傷，實現(xiàn)對胃腸疾病的治療作用[10-13]。 有關(guān)研究證實，電針能顯著提高機體免疫功能水平，通過提高免疫應(yīng)答能力從而增強胃腸功能[14-15]。 但目前較少有關(guān)于針灸通過改善腸道炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，促進十二指腸黏膜損傷修復(fù)，從而治療應(yīng)激性潰瘍的研究。 因此，本實驗以此為切入點，建立應(yīng)激性潰瘍模型小鼠，并分別對“手三里”“足三里”進行電針干預(yù)，觀察各組小鼠十二指腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變，以及炎性細胞因子白細胞介素-1β（interlenkin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、免疫功能相關(guān)分化抗原4（cluster of differentiation 4, CD4）、分化抗原8（cluster of differentiation 8, CD8）及分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A, SIgA）的表達水平，探討電針對十二指腸黏膜損傷修復(fù)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF 級雄性KM 小鼠40 只，體質(zhì)量38～45 g，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2018-0009。 小鼠分籠飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心實驗室，晝夜交替周期為12 h，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對濕度60%～70%。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將40 只KM 小鼠完全隨機分為空白組12只和造模組28 只，造模組建立應(yīng)激性潰瘍模型。 造模結(jié)束后在空白組和造模組中分別隨機抽取4 只小鼠進行模型評價，確認模型制備成功后，將造模組剩余24 只小鼠二次隨機分為3 組：模型組、手三里組及足三里組，每組8 只。 實驗過程遵循國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》，動物實驗倫理號：XMULAC20190142。

1.2 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛（上海滬試實驗器材股份有限公司，批號：342004）；RNA 提取試劑盒（北京艾德萊生物技術(shù)有限公司，批號：RN03）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO 公司，批號：FSQ-101）；Agarose（德國Biofrox公司，批號：1110GR100）；50×TAE（北京索萊寶科技有限公司，批號：T1060-500）；4SGreen Plus 無毒核酸染料（上海生物工程股份有限公司，批號：EA26BA0029）；2×HieffTMPCR（上海翊勝生物科技有限公司，批號：10102ES08）；Trans2K Maker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：BM101）；IL-1β Elisa 試劑盒、CD4 Elisa 試劑盒、CD8 Elisa 試劑盒、SIgA Elisa 試劑盒、TNF-α Elisa 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H002、H156、H157、H108-2、H052）。

低溫高速離心機、低速離心機（美國SCILOGBX公司，型號：D3024R、S1010E）；GloMax 酶標(biāo)儀（美國Promega 公司，型號：GM3030）；振蕩儀、搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：10RTEX-5、TSB-108）；電泳儀（美國BIO-RAD 公司，型號：041BR126545）；超微量分光光度計（美國NanoVue 公司，型號：NanoVue Plus）；熒光顯微鏡、組織包埋機、組織切片機（德國Leica 公司，型號：DM4B、EG1150、RM2235）；一次性無菌針灸針（北京漢醫(yī)醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.17 mm×7 mm）；電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號：SDZ-Ⅱ）；小鼠束縛器（哈爾濱市香坊區(qū)昕楚實驗室用品有限公司，規(guī)格：110 mm×40 mm×30 mm）。

1.3 造模方法

本研究使用束縛-冷浸法制備應(yīng)激性潰瘍模型[16]。 造模前，將小鼠禁食不禁水24 h，然后用束縛器（110 mm×40 mm×30 mm）固定，將小鼠連同束縛器垂直立浸于41 ℃水箱中，水平面齊平胸骨劍突，1 h后取出小鼠，暖風(fēng)吹干，之后恢復(fù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)、飲水。造模結(jié)束后，在空白組和造模組中分別隨機抽取4只小鼠進行模型評價：空白組小鼠鏡下十二直腸黏膜固有層細胞排列規(guī)整，腺體排列整齊，未見炎性細胞浸潤；造模組小鼠鏡下可見十二指腸黏膜組織固有層變薄，組織深染，腺體排列不規(guī)整，組織內(nèi)有廣泛的炎性細胞浸潤等反應(yīng)，提示模型制備成功[17]。

1.4 治療方法

穴位定位參考實驗針灸學(xué)動物穴位定位法[18]。足三里：膝關(guān)節(jié)下方，腓骨小頭下約0.3 cm 處的肌溝中；手三里：前臂背外側(cè)上1/4 分點處的肌溝中。模型制備成功后，手三里組小鼠每日用束縛器固定并電針手三里穴1 次；足三里組小鼠每日用束縛器固定并電針足三里穴1 次；空白組及模型組僅用束縛器固定。所有干預(yù)每次30 min，每日1 次，連續(xù)7 d。

電針方法：使用漢醫(yī)牌一次性無菌針灸針（0.17 mm×7 mm）分別在足三里、手三里直刺1 針，穴位旁開1 mm處，再直刺1 針輔助針，深度約5 mm，兩針連接一對電針治療儀電極。 采用疏密波（疏波時間5 s，密波時間10 s，疏波4 Hz，密波50 Hz，負載電壓2～4 V；輸出脈沖寬度0.5 ms），強度以毫針針體出現(xiàn)輕微顫動為度。

1.5 檢測方法

1.5.1 HE 染色 將各組小鼠十二指腸組織置于4%多聚甲醛中固定，修塊后放進包埋盒中；用流水將多聚甲醛完全沖洗后，乙醇脫水，過夜；石蠟包埋，切片展片（片厚5 μm）。 片子置于60 ℃烘箱2 h 后進行梯度脫蠟，并用PBS 清洗3 次；蘇木精染色后沖洗片子，使用1%氨水返藍；再使用1%伊紅染色15 s 后沖洗，再次梯度脫水后使用中性樹膠封片。分別在100、400 倍率下觀察十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)以及腺體，并使用圖像采集系統(tǒng)將病理圖片進行采集。

1.5.2 ELISA 檢測 將各組小鼠十二指腸組織勻漿，置于4 ℃、12 000 r/min、半徑8 cm 離心20 min，取上清液備用；配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，并取100 μL加入標(biāo)準(zhǔn)孔；取100 μL 待測樣品加入其他孔，混勻后封板溫育；棄去液體甩干后加生物素化抗體工作液，混勻封板溫育；洗板，去液體，用洗滌液浸泡后吸去液體；甩干，洗板5 次；接著每孔加90 μL 底物溶液，封板溫育，最后加終止液50 μL，終止反應(yīng)；15 min 以內(nèi)于450 nm 波長處測量各孔的吸光度（OD）值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個組織指標(biāo)含量。

1.5.3 RT-PCR 檢測 將各組小鼠十二指腸組織用兩步法進行RT-PCR 檢測。 首先設(shè)計引物（表1）；提取mRNA，組織液氮研磨后Trizol 裂解、離心（4 ℃，12 000 r/min，半徑8 cm，10 min）；取上清液，加入0.2 mL 氯仿（每毫升裂解液），震蕩、孵育、離心（4 ℃，12 000 r/min，半徑8 cm，10 min）；取上清液，加上清水相體積一半的乙醇，混勻離心后轉(zhuǎn)移到吸附柱；加去蛋白液后再離心（室溫，12 000 r/min，半徑8 cm，45 s），然后加漂洗液漂洗兩次，離心（室溫，12 000 r/min，半徑8 cm，45 s）；加水洗脫RNA，酶標(biāo)儀測RNA濃度；加Primer mix、RT Enzyme mix、5×RT buffer混勻孵育cDNA；接著cDNA 與Primer F、Primer R、2×HieffTMPCR、DEPC 水混勻；經(jīng)qPCR 程序后瓊脂糖凝膠電泳，成像計算各指標(biāo)含量，RT-PCR圖片采用ImageJ 軟件進行灰度分析，數(shù)據(jù)結(jié)果與相應(yīng)的內(nèi)參進行對比，通過均一化處理進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 RT-PCR 引物信息

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用“±s”表示。 數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性，則使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；若不符合方差齊性，則用Dunnet T3 分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察

空白組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，進食量、飲水量及二便正常，毛發(fā)光澤柔順，體質(zhì)量增加。 造模后，模型組、手三里組及足三里組小鼠精神狀態(tài)欠佳，活動量減少，進食飲水量減少，大便稀軟，毛發(fā)枯槁易脫落，體質(zhì)量下降。 隨著治療進行，足三里組小鼠精神狀態(tài)逐漸改善，進食飲水量、體質(zhì)量穩(wěn)定增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，大便成形；手三里組小鼠一般情況較模型組小鼠有所改善，但改變不及足三里組小鼠明顯。

2.2 各組小鼠十二指腸黏膜組織形態(tài)學(xué)比較

HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠十二指腸黏膜組織固有層細胞排列整齊，腺體排列規(guī)則，未見明顯炎性細胞浸潤。 模型組小鼠十二指腸黏膜組織固有層明顯變薄，排列不規(guī)則，組織深染，十二指腸腺體排列不規(guī)整，有廣泛的炎性細胞浸潤。手三里組與足三里組小鼠十二指腸黏膜組織固有層厚度增加，固有層細胞增加，排列整齊。 詳見圖1。

圖1 各組小鼠十二指腸組織HE 染色觀察結(jié)果

2.3 各組小鼠十二指腸黏膜免疫屏障相關(guān)蛋白含量比較

與空白組相比，模型組十二指腸黏膜組織內(nèi)IL-1β、TNF-α、SIgA 蛋白含量明顯升高（P＜0.01），CD4、CD8 蛋白含量明顯下降（P＜0.01）。 與模型組相比，足三里組IL-1β、TNF-α、SIgA 蛋白含量下降（P＜0.05 或P＜0.01），CD4、CD8 蛋白含量升高（P＜0.05 或P＜0.01）；手三里組IL-1β、TNF-α 蛋白含量下降（P＜0.05），CD4、CD8、SIgA 蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與手三里組相比，足三里組CD8 蛋白含量上升（P＜0.05），IL-1β、TNF-α、CD4 及SIgA 蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組小鼠十二指腸黏膜CD4、CD8、SIgA、IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平比較（±s，n=8）

2.4 各組小鼠十二指腸黏膜免疫屏障相關(guān)基因比較

與空白組相比，模型組IL-1β、TNF-α、SIgA 的mRNA 表達量顯著升高（P＜0.01），CD4、CD8 的mRNA 表達量顯著下降（P＜0.01）。 與模型組相比，足三里組IL-1β、TNF-α、SIgA 的mRNA 表達量下降（P＜0.05），CD4、CD8 的mRNA 表達量升高（P＜0.05）；手三里組IL-1β、TNF-α 的mRNA 表達量下降（P＜0.05），CD4、CD8、SIgA 的mRNA 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與手三里相比，足三里組CD8 mRNA 表達量上升（P＜0.05），SIgA mRNA 表達量下降（P＜0.05），IL-1β、TNF-α、CD4 的mRNA 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3。

圖3 各組小鼠十二指腸黏膜IL-1β、TNF-α、CD4、CD8、SIgA 基因表達水平比較（±s，n=8）

3 討論

應(yīng)激性潰瘍是指機體在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生的以炎癥糜爛、淺表性潰瘍及胃腸道出血為特征的急性胃腸黏膜病變，屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃痛”“嘈雜”等范疇，病位在脾胃[19]。脾胃居中焦，為后天之本，氣血生化之源，乃氣機升降之樞紐。 若脾胃素虛，或久病年老，脾胃衰敗，運化失職，氣機不暢，易致脘腹不通則痛；脾胃氣血化生不足，易致脘腹不榮則痛。 《靈樞·本輸》曰：“大腸屬上，小腸屬下，足陽明胃脈也，大腸小腸，皆屬于胃，是足陽明也。 ”足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴，可健脾和胃、調(diào)和氣血?，F(xiàn)代研究表明，刺激足三里可增強迷走神經(jīng)緊張性，進而提高膽堿能抗炎通路的活力，實現(xiàn)改善胃腸道炎癥的作用[20]。手三里屬手陽明大腸經(jīng)，《針灸大全·席弘賦》中記載其主“肩上痛連臍不休，食癖氣塊”，更有十四經(jīng)主治歌訣中提到“三里消脹穴在手，腹脹不仁癱難走”，可見手三里為古代治療腹痛、腹脹常用穴位。現(xiàn)代臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，手三里具有鎮(zhèn)痛、抗炎的作用[21-24]。 故本研究選用手三里穴作為對照組，以探究足三里穴治療應(yīng)激性潰瘍是否具有特異性。

應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生與胃腸黏膜損傷的因素增加及屏障的保護機制減弱有關(guān)[25]。研究表明，機體處于應(yīng)激狀態(tài)下可能出現(xiàn)胃腸黏膜的炎癥和免疫反應(yīng)的改變，產(chǎn)生大量炎性細胞浸潤和各種細胞因子滲出，使促炎細胞因子與抗炎細胞因子失衡，導(dǎo)致胃腸黏膜損傷[26]。 TNF-α 作為細胞增殖和凋亡的主要促炎細胞因子，在炎性反應(yīng)性腸病的發(fā)病機制中具有重要的調(diào)節(jié)作用[27-29]，可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞進一步合成釋放IL-1β 等[30]。 研究證明，IL-1β 的升高可對血管內(nèi)皮功能造成損害，并促使自由基的合成誘發(fā)高凝狀態(tài)，導(dǎo)致微循環(huán)血栓，影響潰瘍的治療與預(yù)后[31-32]。 本實驗證實，應(yīng)激性潰瘍時，模型組小鼠十二指腸黏膜內(nèi)IL-1β 及TNF-α 的表達水平較空白組小鼠升高，說明應(yīng)激可誘發(fā)胃腸黏膜炎癥，進而激活腸道內(nèi)免疫反應(yīng)。 與模型組相比，經(jīng)電針干預(yù)后的足三里組及手三里組小鼠十二指腸黏膜組織中IL-1β、TNFα 促炎細胞因子表達水平下降，且兩組IL-1β、TNFα 差異無統(tǒng)計學(xué)意義， 提示電針足三里和手三里可能通過降低IL-1β、TNF-α 的表達水平，從而減輕十二指腸炎癥。

腸道內(nèi)的促炎因子分泌增多可影響補體、殺傷細胞及吞噬細胞的活性，調(diào)節(jié)腸黏膜免疫屏障功能進而介導(dǎo)組織損傷過程。 腸黏膜免疫屏障主要由體液免疫和細胞免疫構(gòu)成，二者共同誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，發(fā)揮腸道免疫調(diào)節(jié)作用[33]。 T 淋巴細胞亞群是構(gòu)成細胞免疫的重要組成部分，CD4+T 細胞可以調(diào)控和輔助其他淋巴細胞發(fā)揮功能，CD8 蛋白是殺傷性T 細胞的主要表面標(biāo)志物，CD8+T 細胞通過表面的Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合物分子與CD4+等其他免疫細胞的Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物分子結(jié)合，從而識別其他免疫細胞表面結(jié)合的抗原物質(zhì)，產(chǎn)生殺傷作用，以此對抗致病原[34]。SIgA 是腸道內(nèi)體液免疫的重要參與者，是腸黏膜屏障的第一道屏障，其主要功能是阻斷病原微生物對黏膜的吸附，抑制病原體或細菌增殖、中和毒素，從而達到保護腸道黏膜的作用[35]。有研究表明，CD4 蛋白表達水平降低可刺激B 細胞分泌活躍，從而使體液免疫亢進[36]。與其結(jié)果相似，在本研究中，模型組小鼠CD4、CD8 蛋白及mRNA 表達水平較空白組小鼠降低，SIgA 蛋白及mRNA 表達水平升高，提示在應(yīng)激性潰瘍發(fā)生時，腸道內(nèi)免疫功能紊亂，使腸道黏膜更易受損。與模型組相比，足三里組小鼠CD4、CD8 蛋白及mRNA 表達升高，SIgA 蛋白及mRNA 表達水平顯著下降，而手三里組CD4、CD8、SIgA 蛋白及mRNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明電針足三里可通過調(diào)整細胞和體液免疫，促進十二指腸黏膜損傷修復(fù)。

綜上所述，電針能夠改善應(yīng)激性潰瘍小鼠十二指腸黏膜病理改變，有效調(diào)節(jié)十二指腸炎性因子水平，調(diào)整腸道內(nèi)細胞和體液免疫，從而促進十二指腸黏膜損傷的修復(fù)，且足三里穴較手三里穴調(diào)節(jié)十二指腸黏膜免疫功能效果更佳。