魚類神經(jīng)行為毒性研究進(jìn)展

王旭，閆有利

（遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動物病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 遼陽 111000）

神經(jīng)行為毒性，是有害因素對動物神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)行為產(chǎn)生的損害和影響，它反映外界因素對生物個(gè)體整體水平健康危害程度，是一種非死亡的有害效應(yīng)[1]。近年來，水環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重，環(huán)境中各種污染物在水體中積累，水環(huán)境已成為各類無機(jī)污染物[2]和有機(jī)污染物[3]的主要污染場所，水環(huán)境污染和水質(zhì)安全，受到人們廣泛關(guān)注。魚類是水生態(tài)系統(tǒng)中最重要的物種之一，其組織和器官發(fā)育機(jī)制高度保守[4]，與哺乳動物同源[5]。魚類的游泳行為模式與哺乳動物（包括嚙齒動物和人類）行為模式相似[6]，如其個(gè)體行為中的速度、高度、轉(zhuǎn)彎次數(shù)等，群體行為中的平均距離、分散度、分形維數(shù)等。魚類對水環(huán)境中污染物的變化也很敏感，其神經(jīng)系統(tǒng)能夠?qū)Ω鞣N刺激產(chǎn)生綜合協(xié)調(diào)的應(yīng)答反應(yīng)，其游泳速度、游動距離、游動時(shí)間和絕對轉(zhuǎn)角等游泳行為，因環(huán)境發(fā)生異常而改變，即感覺和運(yùn)動的神經(jīng)反射及信息整合等行為表現(xiàn)，包括社交、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶以及防御能力等社會行為[7]，具有復(fù)雜性、規(guī)律性、特定性、高度可變性以及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[8]。已有研究表明[9]，在極低濃度的污染物暴露中，多種污染物可在魚體內(nèi)富集，誘發(fā)魚類感覺效應(yīng)、運(yùn)動效應(yīng)、認(rèn)知效應(yīng)以及情感和個(gè)性心理效應(yīng)等，改變魚類的游泳行為（游泳速度、游泳距離、絕對轉(zhuǎn)角和活動時(shí)間）和社交行為，致使魚類出現(xiàn)神經(jīng)行為異常，產(chǎn)生神經(jīng)行為毒性。魚類的游泳行為可作為神經(jīng)毒性效應(yīng)的敏感終點(diǎn)指標(biāo)。同時(shí)眾多的試驗(yàn)魚品系具有遺傳背景均一、試驗(yàn)重復(fù)性好、可比性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是研究神經(jīng)行為毒性的重要試驗(yàn)動物。魚類的全基因組學(xué)研究，闡明其生物學(xué)特征和基因組結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為神經(jīng)行為毒性研究提供了重要的分子基礎(chǔ)。現(xiàn)從魚類生物學(xué)特征、試驗(yàn)魚類、全基因組測序和魚類種內(nèi)變異（品系、年齡、性別、個(gè)體差異和社會地位）4 個(gè)方面，簡述魚類神經(jīng)行為毒性研究進(jìn)展，展望今后魚類神經(jīng)行為毒性的研究方向，以期為神經(jīng)行為毒性基礎(chǔ)研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 魚類生物學(xué)特征

魚類生物學(xué)特征，是開展神經(jīng)行為毒性研究的重要基礎(chǔ)。與哺乳動物相同，大部分魚類雌雄異體，表現(xiàn)出兩性異形[4]。在生理結(jié)構(gòu)和功能上，魚類組織和器官與哺乳動物同源，其發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)制與哺乳動物高度保守[4]，如魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有與哺乳動物的同源結(jié)構(gòu)，特別是關(guān)鍵腦區(qū)功能相同[5]。斑馬魚端腦區(qū)背側(cè)（Dm）的內(nèi)側(cè)區(qū)和腹側(cè)端腦區(qū)（Vd）的背核，與哺乳動物杏仁核和紋狀體同源，為探索情緒記憶和動機(jī)行為提供材料，進(jìn)一步支持了魚類作為研究行為神經(jīng)機(jī)制的模式生物。魚類神經(jīng)元的形成及分化等過程與其他脊椎動物相似且高度保守[10]，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)[11]，具有基本脊椎動物大腦結(jié)構(gòu)和組織以及神經(jīng)化學(xué)信號通路[5]，如斑馬魚神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在進(jìn)化上更加保守，更適于開展焦慮相關(guān)障礙研究[12]。

魚類神經(jīng)系統(tǒng)，能夠?qū)Ω鞣N刺激產(chǎn)生綜合協(xié)調(diào)的應(yīng)答反應(yīng)[7-8]。如斑馬魚胚胎，在27 hpf（hour post-fertilization, hpf）可以運(yùn)動（肌肉效應(yīng)初期），48~72 hpf 開始游泳[13]，在4 dpf 開始自由游泳生活[14]，具有晝夜活動節(jié)律[15]，其運(yùn)動行為變化隨早期發(fā)育的過程有序產(chǎn)生，其行為復(fù)雜，特征鮮明，易于采用行為學(xué)試驗(yàn)手段，對視覺、嗅覺和聽覺功能進(jìn)行檢測（趨光試驗(yàn)、驚恐反射試驗(yàn)以及嗅覺偏好等）[8]。目前，已確定斑馬魚在胚胎期、幼魚期和成魚期存在100 多種行為[16]。研究者可從多角度研究斑馬魚群體的社會行為：（1）觀察群體中自由游泳的受試魚個(gè)體，記錄行為參數(shù)，如個(gè)體間距離及個(gè)體的同步運(yùn)動[17]；（2）進(jìn)行社會偏好測試，包括使用社會刺激來研究個(gè)體對群體的行為反應(yīng)[17]。

基于魚類神經(jīng)系統(tǒng)及其表現(xiàn)出的行為特征，神經(jīng)毒理學(xué)研究表明，斑馬魚暴露在藥物以及污染物中，表現(xiàn)出生物累積和一些毒性效應(yīng)，如分子、生化、形態(tài)、生理和行為等變化[18]，其行為學(xué)指標(biāo)與刺激物相關(guān)聯(lián)，與哺乳動物（包括嚙齒動物和人類）相似[6]，證明魚類是研究神經(jīng)行為學(xué)和毒理學(xué)等神經(jīng)毒性表觀效應(yīng)的有效工具和優(yōu)良物種。

2 試驗(yàn)魚類

試驗(yàn)動物具有遺傳背景均一、試驗(yàn)重復(fù)性好、可比性強(qiáng)等特點(diǎn)，被國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)為“活的精密儀器”，是醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件。神經(jīng)行為毒性研究表明，微塑料[9]、重金屬[9]、有機(jī)污染物[19]等污染物暴露，改變斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias melastigma）、金魚（carassius auratus）等試驗(yàn)魚類的游泳行為和社交行為，表明試驗(yàn)魚類是研究神經(jīng)行為毒性的重要材料。目前培育出試驗(yàn)魚類有斑馬魚近交系（Danio rerio）[20]、劍尾魚（Xiphophorus couchianus）[21]、青鳉[22]、虹鳉（Poecilia reticulata）[23]、金魚[24]、虹鱒（Salmo gairdneri）[25]等。育成20 代以上的近交系有斑馬魚近交系（Danio rerio IM[20]）、劍尾魚近交系（Xiphophorus couchianus[21]、X.helleri Cd[21]、X.helleri strigatus[26]、X.helleri guentheri[26]、X.helleri helleri[26]、X.helleri RRB[26]、X.maculatus Jp 163 A[21]、X.maculatus Jp 163 B[21]、X.montezumae cortezi[26]和X.xiphidium[26]）、青鳉近交系（O.latipes HBI-I[27]、O.latipes HNI-II[27]、O.latipes HO4C[28]、O.latipes HO5[28]、O.latipes HdrR[27]、O.latipes HB32D[28]、O.latipes HB11A[28]、O.latipes Hsok[27]和O.latipes Hi3[28]）和花鳉近交系（Poeciliopsis lucida[29]、P.monacha S68-4[29]和P.monacha S68-5[29]）等。眾多品系的試驗(yàn)魚，為神經(jīng)行為毒性研究提供重要的試驗(yàn)動物，保證研究結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性和可靠性。

3 魚類全基因組測序

魚類基因組解析，在魚類遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、生殖生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等基礎(chǔ)研究方面，具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值，是研究魚類神經(jīng)行為毒性的分子機(jī)制基礎(chǔ)。通過參考基因組比較表明，71.4%人類基因與斑馬魚基因同源，47%的人類直系同源基因，與斑馬魚同源基因是一一對應(yīng)關(guān)系，82%人類致病基因、發(fā)育信號傳導(dǎo)通路與斑馬魚基本近似[30]。目前，國外研究者已經(jīng)完成紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、綠河豚（Tetraodon nigroviridis）、青鳉（Oryzias latipes）等29 個(gè)魚類物種的全基因組測序[31]。我國已完成半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、彈涂魚（Scartelaos histophorus, Boleophthalmus pectinirostris, Periophthalmodon schlosseri, Periophthalmus magnuspinnatus）、鯉（Cyprinus carpio）等22 種魚類的全基因組測序和繪制精細(xì)圖譜[32]。在“2019 年國際海洋基因組會議（ICG-Ocean 2019）”上發(fā)布的萬種魚基因組計(jì)劃（Fish 10000 Genomes Project，簡稱Fish10K），已完成105 種基因組測序。另外，還有石斑魚、鰱和黃姑魚（Nibea albiflora）等數(shù)十種魚類的全基因組測序和基因組資源發(fā)掘工作，正在開發(fā)中[32]。聚焦魚類基因組研究，建立高質(zhì)量的魚類基因組數(shù)據(jù)庫，獲取有關(guān)物種的基因組序列信息，為魚類的種質(zhì)鑒定、遺傳育種、動物營養(yǎng)、環(huán)境毒理和病害防治等領(lǐng)域，提供分子基礎(chǔ)，進(jìn)而闡明魚類生物學(xué)特征和基因組結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為神經(jīng)行為毒性研究提供重要的分子基礎(chǔ)。

4 魚類種內(nèi)變異

種內(nèi)變異，是指同種生物不同個(gè)體間的表型或遺傳差異，如品系、年齡、性別和個(gè)體等生物學(xué)性狀差異[33]，不同的表型個(gè)體間表現(xiàn)出高度的行為差異。

4.1 品系

魚類物種資源豐富，品種繁多。目前，研究人員已開發(fā)出3 000 多個(gè)斑馬魚品系和200 多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系（野生型品系除外）。不同品系斑馬魚基因型不同，其行為特征具有品系差異，如豹紋品系斑馬魚，進(jìn)入水體上層的潛伏期長于白化突變品系和野生型斑馬魚，豹紋品系和白化突變品系，在水體上層停留時(shí)間均少于野生型斑馬魚[34]。Benner 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，硒影響不同品系斑馬魚（Nadia、Gaighatta、Scientific Hatcheries 和TM1）行為（水平和垂直游泳位置），這與相關(guān)基因sepp1a、secp43 和dio2 在大腦中呈差異性表達(dá)相關(guān)。在應(yīng)激和焦慮行為方面，不同斑馬魚品系表現(xiàn)出焦慮遺傳差異，如豹紋品系和白化突變系為高焦慮品系，而野生型品系則表現(xiàn)出低焦慮行為[34]，這為量化和確定斑馬魚品系行為特征提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Millot 等[36]利用虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等基因系，評估魚類個(gè)性特征的遺傳變異性，證明不同品系對環(huán)境刺激敏感程度不同。對大口馬蘇大麻哈魚（Oncorhynchus masou macrostomus）品系行為模式研究證明，對于不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的反應(yīng)，其行為特征并不完全相同（20 個(gè)基本行為特征中有17 個(gè)不同）[37]。

4.2 年齡

年齡是神經(jīng)行為學(xué)研究中重要的生物學(xué)變量。在早期發(fā)育過程中，斑馬魚運(yùn)動行為變化隨早期發(fā)育的過程有序產(chǎn)生，其行為復(fù)雜，特征鮮明。如斑馬魚胚胎在咽囊期（24~48 hpf）出現(xiàn)明顯的行為發(fā)育，胚胎出現(xiàn)有節(jié)律地泳動，出現(xiàn)蠕動，且隨胚胎發(fā)育，胚胎泳動加快，節(jié)律性增強(qiáng)。如在原基-5 期（24 hpf），胚胎發(fā)生自發(fā)的軀干和尾部的側(cè)向收縮；在原基-15 期（30 hpf），胚胎收縮速率降低，出現(xiàn)蠕動；在高胸鰭期（42 hpf），仔魚靜息時(shí)側(cè)躺，卵黃囊向上傾斜，觸碰時(shí)會引起強(qiáng)烈而快速反應(yīng)，其蠕動節(jié)律慢[38]；孵出仔魚（48~72 hpf）通常以側(cè)身或以背上位靜息，可以自由游泳[13]。早幼期幼體開始活躍游動，其行為特征可采用游泳速度、游動距離、絕對轉(zhuǎn)角、活動時(shí)間和逃逸行為等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測[14]，具有晝夜活動節(jié)律[15]；幼體對外界刺激，表現(xiàn)出復(fù)雜行為，包括社交、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶以及防御能力等社會行為[39]。隨年齡的增長，斑馬魚的運(yùn)動能力也隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。Philpott 等[40]研究表明，10 月齡斑馬魚，運(yùn)動能力強(qiáng)于32 月齡斑馬魚，證明隨著年齡的增長，斑馬魚運(yùn)動能力呈逐漸下降趨勢。Glazer 等[41]證明，BDE-47（2，2’，4，4’-四溴聯(lián)苯醚）（0.1 μmol/L）對不同年齡斑馬魚神經(jīng)行為毒性不同，幼魚（144 hpf）的運(yùn)動活性降低，成魚（6 月齡）焦慮相關(guān)行為有所減少。

4.3 性別

性別是影響斑馬魚類行為特征的生物學(xué)變量。雌性和雄性斑馬魚的運(yùn)動能力和社會行為并不相同，如10 月齡和22 月齡雄魚的游動能力明顯高于同齡雌魚[40]。在社會行為方面，雄性斑馬魚（TM1、SH、Nadia 和LWT）通常比雌性斑馬魚表現(xiàn)出更勇敢的社交行為[42]和探索行為[43]，并在慢性壓力下，表現(xiàn)出更強(qiáng)的攻擊性及相應(yīng)的皮質(zhì)醇水平[44]。在同一品系中，不同性別斑馬魚的集群行為不同，金色品系和豹紋品系雌魚，更喜歡與同一品系其他個(gè)體集群[45]。多變量數(shù)據(jù)分析表明，群體中雄性比雌性更勇敢[43]。

斑馬魚對藥物反應(yīng)存在性別依賴性。對可卡因戒斷研究發(fā)現(xiàn)，雌魚焦慮樣行為出現(xiàn)較早，而雄魚的焦慮樣行為則更強(qiáng)烈、更持久[46]。Nielsen等[47]研究證明，艾司西酞普蘭（Escitalopram）影響斑馬魚的行為反應(yīng)，且存在明顯的性別差異。如暴露于艾司西酞普蘭（1.50 μg/L）中，雌魚最快游泳速度減慢，停留次數(shù)減少，并表現(xiàn)出更勇敢的行為；而雄魚則出現(xiàn)最快游泳速度減慢的現(xiàn)象。艾司西酞普蘭對雄魚和雌魚的攝食行為有影響，艾司西酞普蘭（0.10～1.50 μg/L）顯著減少雄魚攝食時(shí)間（減少27%）和最長攝食持續(xù)時(shí)間（減少42%），總攝食時(shí)間顯著縮短73%，而雌魚僅表現(xiàn)為最長攝食時(shí)間顯著縮短41%[47]，可見，艾司西酞普蘭對雄性斑馬魚的攝食行為影響更為顯著。Singer 等[48]研究證明，氟西?。╢luoxetine）和尼古丁（nicotine）影響不同性別斑馬魚的游泳速度，如氟西?。?0 mg/L）和尼古?。? mg/L）暴露雄魚的游泳速度略快于雌魚，但雌魚的游泳速度更穩(wěn)定。

4.4 個(gè)體差異

為了更好地理解種群中魚類個(gè)體差異，Araujo-Silva 等[49]評估酒精對不同類型斑馬魚行為特征的影響，結(jié)果表明，勇敢型斑馬魚，在無乙醇暴露時(shí)，游泳速度更快，而膽怯型斑馬魚在無乙醇和0.10%乙醇暴露時(shí)，出現(xiàn)比最快游泳速度更快的現(xiàn)象。證明乙醇影響不同類型斑馬魚行為特征，勇敢型斑馬魚對這些變化更具抵抗力。不同類型斑馬魚，在乙醇作用下，表現(xiàn)出的集群（社會）行為也不相同。勇敢型個(gè)體的集群效應(yīng)隨乙醇濃度增加而增強(qiáng)；與勇敢型斑馬魚表現(xiàn)不同，膽怯型個(gè)體，則在無乙醇暴露時(shí)，表現(xiàn)出明顯的集群效應(yīng)，而在0.1%～0.5%乙醇暴露時(shí)，其集群效應(yīng)明顯減弱[50]。魚類行為差異，可能與其體內(nèi)基因表達(dá)以及代謝物的水平相關(guān)。Lguchi[37]評估大口馬蘇大麻哈魚2 個(gè)家系中個(gè)體行為特征，結(jié)果表明，魚類個(gè)性行為可能具有遺傳基礎(chǔ)。Filby 等[51]研究證明，與攻擊行為相關(guān)的基因，如雌激素受體（esr1、esr2a 和esr2b）和色氨酸代謝（tph1a、tph1b 和tph2）基因，在大腦表達(dá)因性別而異，表明斑馬魚個(gè)性行為可能與基因表達(dá)有關(guān)[52]。Dahlbom 等[53]研究表明，斑馬魚的行為差異，可能與其體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺、5-羥色胺及其代謝物等）水平相關(guān)，雌性個(gè)體前腦中的5-羥色胺及其代謝物水平較低，但多巴胺水平較高。

4.5 社會地位

在群居性魚類中，不同個(gè)體在群體中社會地位不同，其血漿皮質(zhì)醇濃度[54]、代謝率[55]、增長率[56]、肝臟能量儲備[55]、抗病性[57]、鰓的鈉吸收率[58]以及銅和銀的吸收率[59]均不相同，可能導(dǎo)致其對重金屬敏感度和神經(jīng)行為毒性不同。Sloman 等[59]通過研究群體中不同社會地位虹鱒（Oncorhynchus mykiss）對銅和銀的吸收強(qiáng)度，驗(yàn)證群體中處于不同社會地位個(gè)體對重金屬吸收率不同。Henry 等[60]研究銅對藍(lán)鰓太陽魚（Lepomis macrochirus）群體社會行為的影響，表明在銅（≥0.034 mg/L）暴露期間，太陽魚社會群體行為發(fā)生顯著變化，如處于劣勢地位的個(gè)體，出現(xiàn)咳嗽、打哈欠和甩鰭的頻率高于種群中其他個(gè)體，而處于優(yōu)勢地位的太陽魚次之，但其攻擊性增強(qiáng)，表明太陽魚個(gè)體在社會群體中地位與其重金屬敏感度和神經(jīng)行為毒性相關(guān)。

5 展望

5.1 注重受試試驗(yàn)魚類的多樣性

在目前神經(jīng)行為毒性研究中，受試試驗(yàn)魚類多為單一物種（斑馬魚），而研究物種單一化，導(dǎo)致研究人員不能科學(xué)、系統(tǒng)地確定污染物的神經(jīng)行為毒理學(xué)效應(yīng)。應(yīng)選取2 種或2 種以上具有代表性的試驗(yàn)魚類（如淡水魚類和海水魚類），開展神經(jīng)行為毒性研究，科學(xué)、準(zhǔn)確地確定污染物對魚類的神經(jīng)行為毒性。

5.2 建立魚類神經(jīng)行為毒性數(shù)據(jù)庫

結(jié)合目前魚類神經(jīng)行為毒性研究，建議以試驗(yàn)魚類為研究材料，利用計(jì)算機(jī)圖像跟蹤處理技術(shù)，采用圖像解析法，系統(tǒng)地開展魚類神經(jīng)行為毒性研究，明確魚類游泳行為參數(shù)，確定魚類游泳行為模式，制定魚類神經(jīng)行為毒性標(biāo)準(zhǔn)，建立魚類神經(jīng)行為毒性數(shù)據(jù)庫，為水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

5.3 解析魚類神經(jīng)行為毒性分子機(jī)制

在生命科學(xué)領(lǐng)域，多組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等）技術(shù)和方法日趨完善，魚類神經(jīng)行為毒性研究應(yīng)結(jié)合魚類神經(jīng)行為模式，利用組學(xué)研究思路和手段，在分子水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平和代謝物水平方面，開展魚類神經(jīng)行為毒性研究工作，進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，揭示魚類神經(jīng)行為毒性的致毒機(jī)制。

6 結(jié)語

魚類是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的物種之一，生理結(jié)構(gòu)與哺乳動物同源，具有高度發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，其行為具有復(fù)雜性、規(guī)律性、特定性、高度可變性以及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。魚類對水環(huán)境中污染物的變化最為敏感，能夠?qū)Ω鞣N刺激產(chǎn)生綜合協(xié)調(diào)的應(yīng)答反應(yīng)，改變行為模式，表現(xiàn)為神經(jīng)行為毒性。魚類的游泳行為可作為神經(jīng)毒性效應(yīng)的敏感終點(diǎn)指標(biāo)。魚類生物學(xué)特征是開展神經(jīng)行為毒性研究的重要基礎(chǔ)。眾多品系的試驗(yàn)魚為神經(jīng)行為毒性研究提供了重要的試驗(yàn)動物。魚類基因組序列信息，為魚類行為學(xué)提供分子基礎(chǔ)。魚類種內(nèi)變異，為研究同一物種不同的表型個(gè)體間表現(xiàn)出高度的神經(jīng)行為毒性差異，提供重要的試驗(yàn)材料。魚類是研究神經(jīng)行為毒性的重要物種。