miR-149-5p 通過MSH5/Wnt 信號通路調控膠質瘤細胞惡性生物學行為

馮 毅 ，王小峰 ，白西民 ，姚 勝 ，黨俊濤 ，趙云潔 ，蔡 冰

（1）渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)外科;2）病理科，陜西 渭南 714000）

膠質瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤。據(jù)報道，每年約有14 000 例新增的膠質瘤患者[1]，且老年人具有較高的發(fā)病率。盡管目前手術切除以及放化療等醫(yī)學技術取得了很大的進步，但患者的預后仍然較差，臨床上仍無法徹底治愈惡性程度較高的膠質瘤。因此，探索膠質瘤的潛在發(fā)病機制，尋找新的預后標志物迫在眉睫。miRNA 是由18～25 個核苷酸組成的非編碼RNA，已被廣泛報道參與調節(jié)腫瘤細胞的生理過程[2-3]，通過與靶mRNA 的異常表達和交叉調節(jié)可作為腫瘤的診斷和預后標志物。例如：miR-4 319 在甲狀腺癌組織和細胞中下調，抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化[4]。miR-149 是腫瘤中具有廣泛調控作用的miRNA，由2q37.3 上的MIR149 基因編碼。Xu B 等[5]報道，促進miR-149-5p 表達可增強替莫唑胺對膠質瘤細胞的毒性。但miR-149-5p 在膠質瘤中的作用機制尚不清楚。因此，本研究將探討miR-149-5p 對膠質瘤細胞惡性生物學行為的調控作用及其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集在渭南市中心醫(yī)院就診并確診為膠質瘤患者的腫瘤組織樣本30 例，在距腫瘤組織2 cm處獲得相鄰的癌旁組織樣本（即對照組），在收樣前患者知情并簽署知情同意書。采集樣本的患者除手術治療外未接受其他治療。本研究工作遵循世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言進行，同時獲得了渭南市中心醫(yī)院倫理委員會的批準（2023 研004-3）。

1.2 細胞系

膠質瘤細胞系A172（貨號：CL-0012，Pricella，武漢）、U251（貨號：CL-0237，Pricella，武漢）、HS683（貨號：CL-0362，Pricella，武漢）、H4（貨號：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形膠質細胞HA1800（貨號：AC340443）和293T 細胞（貨號：KMCC-001-0255）購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

90%高糖DMEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司。PrimeScript?RT 試劑盒和gDNA Eraser 購自Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor 序列合成由吉瑪基因提供技術支持。MSH5 抗體購自ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2 一抗購自Abcam。Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、胰蛋白酶、CCK-8 試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio。Hoechst33342 試劑、Wnt 通路抑制劑Triptonide 以及Wnt 通路激活劑HLY78 購自MedChemExpress。熒光顯微鏡購自萊卡。離心機購自深圳瑞沃德。細胞培養(yǎng)箱購自Eppendorf。Bio-RAD 蛋白成像系統(tǒng)購自上海艾研。

1.4 細胞培養(yǎng)

A172、U251、HS683、H4 細胞分別接種于含10% FBS、1% P/SH 的DMEM 培養(yǎng)基。A1800 細胞接種于含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中。293T 細胞培養(yǎng)在含10% FBS、1% Glutamax 和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基內。培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.5 細胞轉染和處理

取生長良好的A172 細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于不含抗生素的培養(yǎng)基中。次日，根據(jù)Lipofectamine 2000 脂質體轉染試劑盒說明書，分別將NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 以及 pcDNA-MSH5分別轉染至A172 細胞。待細胞培養(yǎng)48 h 后，分別檢測轉染效率，成功轉染的細胞用于后續(xù)實驗。轉染的pcDNA-MSH5 的A172 細胞再根據(jù)試劑說明分別用Triptonide 和HLY78 處理。

1.6 RT-qPCR 實驗

TRIzol 試劑提取總RNA，并使用PrimeScript?RT 試劑盒和gDNA Eraser 將1 000 ng RNA 逆轉錄為cDNA。使 用SYBR? Premix Ex Taq? II 和Applied Biosystems 7 500 實時PCR 系統(tǒng)進行實時聚合酶鏈式反應。2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達。U6 作為miRNA 的內參。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 CCK-8 實驗

CCK-8 用于測定細胞活力。調整細胞密度，向96 孔板的每孔中接種1 000 個A172 細胞，每孔100 μL。培養(yǎng)板置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96 h 向每孔中添加10 μL CCK-8 試劑，通過酶標儀測定細胞的光密度值。

1.8 Western blot 實驗

細胞在冰上含有蛋白酶抑制劑的RIPA 溶液中裂解。BCA 試劑盒檢測蛋白質的濃度。將分離的蛋白質進行SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后轉移至PVDF 膜 上。將膜與一抗（MSH5：0.05 μg/mL；GAPDH：1∶2 000；GSK3β：1∶2 000；βcatenin：1∶4 000；AXIN2：1 μg/mL）進行過夜孵育，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育2 h。經(jīng)ECL 化學發(fā)光底物曝光后用蛋白成像系統(tǒng)采集圖像。Image J 軟件用于分析條帶灰度值。

1.9 EDU 實驗

收集對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)在96 孔板中，用100 μL 含20 μmol/L EdU 的培養(yǎng)基處理。在37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育2 h，用4%多聚甲醛分別固定各組細胞30 min，再置于含0.5% Triton-X-100 的PBS 溶液中孵育20 min。Hoechst33342 溶液染細胞核。熒光顯微鏡觀察染色結果并拍照記錄。

1.10 Transwell 檢測遷移和侵襲

成功轉染的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，收集細胞并計數(shù)。將4×104個細胞用100 μL 無血清培養(yǎng)基懸浮制得細胞懸液并接種至Transwell 小室上室，將含10% FBS 的完全培養(yǎng)基加至小室下室。Transwell 小室置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后用4%多聚甲醛固定細胞0.1%結晶紫溶液染色。顯微鏡拍照并計數(shù)。侵襲實驗接種細胞前在小室上室中加入稀釋后的Matrigel 基質膠，膠凝固后再接種細胞，其余步驟與遷移實驗相同。

1.11 流式細胞術檢測細胞周期

取生長良好的各組細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，重懸于PBS 中。然后在冰冷的70%乙醇中過夜固定。隨后，1 000 r/min 條件下將細胞離心5 min，并重懸在50 μL RNase A 中，于37 ℃下孵育30 min。將400 μL 碘化丙啶（PI）細胞懸液中混勻，孵育30 min，通過流式細胞儀進行檢測。

1.12 流式細胞術檢測細胞凋亡率

采用雙染法Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。將轉染后的細胞接種至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集細胞與Annexin V-FITC 試劑在常溫中避光孵育15 min，然后再與PI 溶液避光孵育15 min。通過流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.13 雙熒光素酶報告基因實驗

經(jīng)PCR 擴增MSH5 的3′-UTR（MSH5-WT）并插入p-GL3 報告載體中，同時構建與miR-149-5p 具有靶向結合位點的MSH5 3′-UTR 突變序列（MSH5-MUT），并轉入p-GL3 報告載體。將NC mimic 或miR-149-5p mimic 分 別與MSH5-WT 或MSH5-MUT 經(jīng)Lipofectamine 2000 共轉染至293T細胞中。轉染48 h 后，通過雙熒光素酶測定法分析熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性作為內部參照。

1.14 統(tǒng)計學處理

每組實驗均進行3 次重復。GraphPad Prism8.0用于數(shù)據(jù)分析并作圖。來自三個及以上獨立重復實驗的數(shù)據(jù)均表示為“均數(shù)±標準差”。非配對t檢驗用于分析2 組間的差異。單因素方差分析用于分析多組間的差異，Tukey 檢驗用于多組間的兩兩比較。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-149-5p 在膠質瘤組織和細胞中的表達

收集膠質瘤患者的腫瘤組織及其對應的癌旁組織，通過RT-qPCR 檢測顯示，miR-149-5p 腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織（圖1A，P＜0.000 1）。此外，miR-149-5p 在人膠質瘤細胞系A172、U251、HS683、H4 中的表達明顯低于人正常星形膠質細胞HA1800（圖1B，P＜ 0.000 1）。由此，推測miR-149-5p 在膠質瘤組織和細胞系中的低表達與膠質瘤的發(fā)展密切相關。

圖1 miR-149-5p 在膠質瘤組織和細胞中的表達Fig.1 miR-149-5p was downregulated in glioma tissues and cells

2.2 miR-149-5p 對A172 細胞惡性生物學行為的影響

為進一步探索miR-149-5p 對膠質瘤細胞的作用機制，分別在A172 細胞中轉染NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor。檢測顯示，轉染miR-149-5pmimic 明顯增加miR-149-5p 的表達，轉染miR-149-5p inhibitor 組 中miR-149-5p 表達降 低。CCK-8、EDU、Transwell 以及流式細胞術檢測表明，過表達miR-149-5p 明顯抑制A172 細胞的增殖（圖2B、2C 和2F，P＜ 0.01）、遷移（圖2D 和2G，P＜ 0.05）和侵襲（圖2E 和2H，P＜ 0.01），促進G1 期細胞比例（圖3A 和3B，P＜ 0.01）以及凋亡率（圖3C 和3D，P＜ 0.01）。與NC inhibitor 組相比，敲降miR-149-5p 組中細胞的增殖活力（P＜ 0.05）、遷移（P＜0.05）和侵襲（P＜ 0.05）能力顯著升高，G1 期細胞比例（P＜ 0.05）以及凋亡水平（P＜ 0.05）降低。綜上可知。過表達miR-149-5p 可顯著抑制A172 細胞的增殖、轉移和細胞周期，誘導細胞凋亡。敲降miR-149-5p 可明顯促進A172 細胞的惡性生物學行為。

圖2 miR-149-5p 對A172 細胞惡性生物學行為的影響Fig.2 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

圖3 miR-149-5p 對A172 細胞惡性生物學行為的影響Fig.3 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

2.3 miR-149-5p 靶向MSH5

通過starbase 數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，MSH5 與miR-149-5p 具有靶向結合序列，見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗驗證證實，過表達miR-149-5p可明顯抑制MSH5 野生型載體的熒光素酶活性見圖4B，P＜ 0.05），而對MSH5 突變型載體的熒光素酶活性無顯著作用（P＞ 0.05。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫預測顯示，MSH5 在膠質瘤組織中表達降低（圖4C，P＜ 0.01）。RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)，過表達miR-149-5p 可抑制MSH5 的蛋白表達（圖4D，P＜0.01），而敲降miR-149-5p 組A172 細胞中MSH5表達顯著增加（圖4E，P＜ 0.01）。由此證實，miR-149-5p 靶向負調控MSH5。

圖4 miR-149-5p 靶向MSH5Fig.4 miR-149-5p targeted MSH5

2.4 miR-149-5p 靶向MSH5 調控A172 細胞的惡性生物學行為

為進一步探索miR-149-5p 調控MSH5 對A172 細胞惡性生物學行為的影響，分別在A172細胞中轉染sh-NC、sh-MSH5 和sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot 結果見圖5A 和5B，轉染sh-MSH5 組A172 細胞中MSH5 的蛋白表達低于sh-NC 組（P＜ 0.001），轉染sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 組中MSH5 的蛋白表達高于sh-MSH5 轉染組（P＜ 0.05）。通 過CCK-8、EDU、Tranwell 和流式細胞術檢測表明，敲降MSH5 可顯著抑制A172 細胞的增殖活力（圖5C～5E，均P＜ 0.01）、遷移（圖5F 和5G，P＜ 0.01）和侵襲（圖5H 和5I，P＜ 0.05），促進G1 期細胞比例（圖6A和6B，P＜ 0.01）以及細胞凋亡率（圖6C 和6D，P＜ 0.001）。同時敲降miR-149-5p 和MSH5 組中細胞的增殖（P＜ 0.05）、遷移（P＜ 0.05）和侵襲（P＜ 0.05）能力高于敲降MSH5 組，G1 期細胞比例（P＜ 0.05）和凋亡（P＜ 0.05）水平低于僅敲降MSH5 組。綜上所述，敲降miR-149-5p 靶向MSH5，可逆轉敲降MSH5 對A172 細胞惡性生物學行為的抑制作用。

圖5 miR-149-5p 靶向MSH5 調控A172 細胞的惡性生物學行為Fig.5 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

圖6 miR-149-5p 靶向MSH5 調控A172 細胞的惡性生物學行為Fig.6 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

2.5 MSH5 調控Wnt 信號通路對A172 細胞的作用

Wnt 信號通路被報道在膠質瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用，因此，筆者進一步探討miR-149-5p/MSH5 分子軸是否通過Wnt 信號通路而調控膠質瘤的進程。分別用Wnt 通路抑制劑Triptonide 以及Wnt 通路激活劑HLY78 處理轉染pcDNA-MSH5 的A172 細胞。檢測結果見圖7A，與pcDNA-NC 作用相 比，pcDNA-MSH5 組 中MSH5（圖7B，P＜ 0.001）、GSK3β 表達降低（圖7C，P＜ 0.001），β-catenin（圖7D，P＜ 0.05）和AXIN2（圖7E，P＜ 0.01）表達升高。與pcDNA-MSH5 組相比，pcDNA-MSH5+Triptonide 組中GSK3β 表達升高（P＜ 0.001），β-catenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.01）表達降低；而pcDNA-MSH5+HLY78 組 中GSK3β 表達降 低（P＜ 0.001），βcatenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.05）表達升高。過表達MSH5 且經(jīng)Triptonide 處理可顯著下調過表達MSH5 對A172 細胞的增殖（圖7F～7H，均P＜0.01）、遷移（圖7I～7J，P＜ 0.01）和侵襲（圖7K～7L，P＜ 0.01）的促進作用以及對A172 細胞的G1期細胞比例（圖8A～8B，P＜ 0.05）和凋亡水平（圖8C～8D，P＜ 0.05）的抑制作用。過表達MSH5 且經(jīng)HLY78 處理可顯著上調過表達MSH5對A172 細胞的增殖（均P＜ 0.05）、遷移（P＜ 0.05）和侵襲（P＜ 0.05）的促進作用以及對A172 細胞的G1 期細胞比例（P＜ 0.05）和凋亡水平（P＜ 0.05）的抑制作用。綜上表明，過表達MSH5 通過激活Wnt 信號通路促進A172 細胞的惡性表型。

圖7 MSH5 調控Wnt 信號通路對A172 細胞的作用Fig.7 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

圖8 MSH5 調控Wnt 信號通路對A172 細胞的作用Fig.8 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

3 討論

膠質瘤占原發(fā)性腦腫瘤的80%，由于有空間占位效應，使患者的顱內壓升高，可能導致患者嘔吐、視力喪失或出現(xiàn)癲癇癥狀[6]。同時，膠質瘤具有較強的侵襲性，手術很難將病灶完全切除[7]。因此，越來越多的研究者開始研究靶向治療，以期通過尋找有效的生物標志物為膠質瘤提供新的治療方案。

miRNA 在基因表達中具有重要的調控作用，據(jù)估計，約有三分之一的蛋白表達受miRNA 的調控[8-9]。miR-149-5p 被證實在多種腫瘤細胞中作為抑癌因子抑制腫瘤的進程。Li Q 等[10]證明，在胃癌組織和細胞系中miR-149-5p 低表達，過表達miR-149-5p 顯著抑制胃癌細胞的增殖和轉移并誘導細胞凋亡。在乳腺癌細胞中，circ-0072995 通過靶向下調miR-149-5p 可促進乳腺癌細胞的惡性表型和無氧糖酵解[11]。miR-149-5p 靶向下調RGS17，抑制前列腺癌細胞的活力、增殖和遷移[12]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-149-5p 在膠質瘤組織和細胞系中表達降低，過表達miR-149-5p 顯著抑制膠質瘤A172 細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞G1 期的比例并誘導細胞凋亡。而敲降miR-149-5p 可促進A172 細胞的增殖和轉移，抑制G1 期細胞比例以及細胞凋亡率。此外，miR-149-5p 也被報道參與炎癥及代謝類疾病的調控[13-15]。例如：miR-149-5p 可抑制骨關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎中促炎細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平[15]。黃芪多糖通過上調miR-149-5p 的表達，改善高糖和棕櫚酸誘導的小鼠胰腺β 細胞的增殖和胰島素的分泌[13]。過表達miR-149-5p 顯著聚集尿酸誘導的干細胞中甘油三酯的積累[16]。

MutS 同源物5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS 蛋白家族的成員，與MSH4 形成異二聚體復合物，參與DNA 配錯修復和減數(shù)分裂重組，在DNA 雙鏈斷裂的同源重組修復過程中發(fā)揮重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MSH4 和MSH5 中的遺傳變異是男性不育的相關原因[18]。MSH5 突變可損害DNA 同源重組修復，可能導致非綜合性原發(fā)性卵巢功能不全[19]。敲低lncRNA HCP5 抑制YB1 與MSH 啟動子在的結合，抑制MSH5 的轉錄激活，進而抑制DNA 雙鏈斷裂的修復過程，促進卵巢顆粒細胞的凋亡[20]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)MSH5 是miR-149-5p 的靶基因，MSH5 在膠質瘤組織和細胞中高表達，敲降miR-149-5p 靶向上調MSH5促進A172 細胞惡性表型。

糖原合成酶激酶3-β（glycogen Synthase Kinase 3-β，GSK3β）是GSK3 的兩種異構體之一，可通過介導Wnt/β-catenin 信號通路參與調節(jié)糖原合成、蛋白質合成、細胞增殖、細胞分化以及免疫功能和炎癥等過程[21-23]。本研究中，筆者證明，過表達MSH5 通過抑制GSK3β，促進βcatenin 和AXIN2 表達，從而促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-149-5p 在膠質瘤組織和細胞系中低表達，敲降miR-149-5p 通過靶向上調MSH5，抑制GSK3β，促進βcatenin 和AXIN2 通路蛋白表達，進而促進膠質瘤細胞的生長和轉移，并抑制細胞凋亡。