DNA 甲基化與精神分裂癥的研究進展

尹文卅 ，盧玉梅 ，佟金蓮 ，聶勝潔 ，阮 冶

（1）云南省精神病醫(yī)院醫(yī)務部;2）云南省精神衛(wèi)生防治中心;3）昆明醫(yī)科大學附屬精神衛(wèi)生中心，云南 昆明 650224;4）昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南 昆明 650500;5）昆明醫(yī)科大學研究生院，云南 昆明 650500）

據(jù)統(tǒng)計，全球大約有2 300 萬人患有精神分裂癥（schizophrenia，SCZ），與普通人群相比SCZ 患者的預期壽命減少了15～20 a[1-2]。SCZ 確切的遺傳模式不清，發(fā)病機制尚未明。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SCZ 是一種遺傳異質性疾病，由遺傳學，表觀遺傳學，神經(jīng)生物學和環(huán)境因素等多種因素共同作用而形成[3]。通過全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）以及單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等研究發(fā)現(xiàn)，SCZ 的發(fā)病機制與環(huán)境、遺傳以及表觀遺傳調控（尤其是DNA 甲基化）改變基因表達有關[4-6]。

盡管SCZ 的研究逐漸增加，但目前尚未發(fā)現(xiàn)明確的病理生理機制、分子診斷或精確的生物學標志物。DNA 甲基化有望更好地理解SCZ 病理生理學機制，并有希望獲得精確的生物學標志物。基于此，現(xiàn)對SCZ 中不同基因DNA 甲基化研究進行綜述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉移酶的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸的一個甲基基團轉移到DNA 分子堿基上。甲基化部位主要發(fā)生在CpG 島的基因組中富含胞嘧啶和鳥嘌呤的片段[7]，通常在胞嘧啶殘基的第5 個碳上，形成5-甲基胞嘧啶[6]。該過程由一系列DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化和維持，包 括DNMT1，DNMT3A 和DNMT3B 等多種DNA 甲基轉移酶。由胞嘧啶環(huán)第5 位碳原子的共價甲基化，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）[8-9]。由于CpG 島通常分布在基因的啟動子區(qū)域，經(jīng)常出現(xiàn)在轉錄起始位點周圍，所以啟動子區(qū)DNA 甲基化對調控基因的轉錄具有重要作用，通常與基因轉錄活性的降低有關。

2 DNA 甲基化測序

精神分裂癥是一種復雜的疾病，在DNA 甲基化方面涉及諸多基因。也有多種方法可以進行DNA 甲基化的測序。例如：

Tet-酶輔助亞硫酸氫鹽測序（tet-assisted bisulfite sequencing，TAB-seq）是 一種結合Tet 酶和亞硫酸鹽測序的方法。Tet 酶可以將5-甲基脫氧胞苷（5mC）轉化為5-羥甲基脫氧胞苷（5hmC），而亞硫酸鹽測序可以區(qū)分5mC 和5hmC。通過二者結合，TAB-seq 可以提供更詳細的DNA 甲基化信息，包括5mC 和5hmC 的定位和相對豐度，在研究精神疾病DNA 甲基化動態(tài)變化和表觀遺傳學調控方面具有重要意義[10]。

APOBEC-偶聯(lián)表觀遺傳測序（APOBECcoupled epigenetic sequencing，ACE-seq）是APOBEC 酶催化胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，其特異性地發(fā)生在甲基化的胞嘧啶殘基上，導致5-甲基胞嘧啶（5mC）轉化為胸腺嘧啶（T）。通過文庫制備后進行高通量測序，對測序數(shù)據(jù)進行分析，以確定胞嘧啶脫氨事件的位置和模式，并將測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行比較，從而確定胞嘧啶脫氨發(fā)生的具體位點。ACE-seq 可以幫助揭示胞嘧啶脫氨在DNA 損傷和修復過程中的作用，研究發(fā)育過程中的DNA 甲基化動力學、疾病進展以及對環(huán)境刺激的反應等[10]。

氧化亞硫酸氫測序（oxidative bisulfite sequencing，oxBS-seq）是一種基于氧化亞硫酸鹽的測序方法。亞硫酸氫鹽測序（BS-seq）是用單堿基分辨率量化DNA 甲基化的金標準，不同于傳統(tǒng)的BS-seq，oxBs-seq 在亞硫酸鹽處理之前會進行氧化處理，將5hmC 轉化為5-羥甲基脫氧胞苷酸（5fC）和5-羧甲基脫氧胞苷酸（5caC），通過測序技術區(qū)分5mC、5hmC、5fC 和5caC，從而提供更全面的DNA 甲基化信息[11]。

納米孔技術測序（nanopore technologies sequencing）下是第三代（長讀）測序方法，可以讀取較長的DNA 片段，與Illumina 常用的“合成測序”方法相比，納米孔技術的測序是基于電流的微小變化[12]。在測序過程中，DNA 鏈穿過嵌入在聚合物膜上直徑約1.8 nm 的蛋白質納米孔，當DNA 鏈進入孔內時，電流根據(jù)孔內的DNA 堿基而變化，從而使得檢測表觀遺傳變化成為可能[12]。其優(yōu)點在于它具有高通量、實時性和單分子級別的分辨率，能提供全基因組信息，長讀取允許檢測罕見變異、缺失、插入、重復區(qū)域以及DNA 甲基化等[12-13]。對于研究精神疾病DNA 甲基化的動態(tài)變化和空間分布具有重要意義，其缺點是樣品檢測價格較為昂貴。

3 DNA 甲基化與SCZ

在SCZ 的發(fā)生和發(fā)展過程中，DNA 的甲基化是最早發(fā)現(xiàn)與SCZ 相關的表觀遺傳修飾之一。同時，DNA 甲基化是表觀遺傳學研究最為廣泛的表觀遺傳學修飾類型。從GWAS 分析結果來看，SCZ 可能是不同基因甲基化變化的共同作用的結果[14-15]。多項研究表明，在SCZ 中發(fā)現(xiàn)了多個基因的甲基化異常。諸如，SCZ 存在RELN、HTR2A、SOX10等基因啟動子DNA 甲基化異常。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)SCZ 患者大腦皮質灰質和白質的DNA 甲基化差異顯著[16]。Chen 等[17]進行的一項研究確定了血細胞中SCZ 特異性DNA 甲基化特征，并且這些特征（如背外側前額葉皮層的甲基化差異）在尸檢樣本中仍可以觀察到。從神經(jīng)遞質通路來看，SCZ 中DNA 甲基化涉及5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸等多種神經(jīng)遞質通路。多巴胺（Dopamine，DA）、5-羥色胺（Serotonin，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）和腦源 性神經(jīng) 營養(yǎng)因 子（Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF）等多個基因甲基化與SCZ 明顯相關[18-19]。從神經(jīng)分化與發(fā)育看，Lisoway 等人關于SCZ 的研究發(fā)現(xiàn)SCZ 患者DNA甲基化與神經(jīng)分化和發(fā)育相關基因富集方面存在顯著差異[5]。早期大腦發(fā)育過程中的DNA 甲基化也與SCZ 風險有關，DNA 甲基化容易受到藥理作用等環(huán)境因素的影響，可作為尋找治療SCZ 更有效的治療新靶點[20]。最近，在應用甲基化DNA免疫沉淀芯片研究SCZ 患者外周血單核細胞基因組DNA 甲基化失調中發(fā)現(xiàn)：SHANK3啟動子高甲基化，且其高甲基化與左側下葉皮質表面區(qū)域呈負相關，與首發(fā)SCZ 中陰性癥狀分數(shù)呈正相關。轉錄因子YBX1 進一步發(fā)現(xiàn)在誘導多能干細胞衍生的皮質中間神經(jīng)元（cINs）而不是谷氨酸能神經(jīng)元中與SHANK3啟動子的高甲基化區(qū)結合；使用shRNAs 在cINs 中證實 了YBX1 對SHANK3 表 達的直接正向調節(jié)作用[21]。

總之，在SCZ 中，有來自不同組織的多個候選基因研究表明，不同的候選基因在SCZ 的病例對照研究中存在DNA 甲基化的差異。

4 SCZ 與不同基因DNA 甲基化

4.1 MAOA 基因

在人類中，MAOA 基因位于X 染色體（Xp11.3）上與MAOB 相鄰的位置。這兩個基因具有相似的外顯子-內含子組成，共有16 個外顯子，序列一致性約為70%。在體內體外實驗中，MAOA 啟動子甲基化與MAOA 表達呈負相關。甲基化機制還負責調節(jié)新發(fā)現(xiàn)的MAOA 相關的lncRNA，該lncRNA 抑制了大腦中的MAOA 表達[22]。此外，MAOA 基因的甲基化水平與反社會行為，暴力行為，Brunner 綜合征以及SCZ 等多種行為和疾病有關。在偏執(zhí)型SCZ 中，與健康男性對照相比SCZ 男性患者中MAOA 啟動子CpG 位點甲基化增加也已被證實。與之類似地，學者池野田等研究團隊通過焦磷酸測序技術，對5-羥色胺轉運體基因（SLC6A4）DNA 甲基化進行研究，同樣發(fā)現(xiàn)類似的性別差異，在男性SCZ 患者中SLC6A4的CpG位點顯著超甲基化[23]。此外，Yang 等[18]也表明MAOA 甲基化水平在SCZ 患者中顯著升高，并且男性和女性患者的MAOA 甲基化水平與精神分裂癥呈現(xiàn)正相關。

4.1.1 COMT 基因COMT基因位于22q11.2 染色體的片段中，敲除該基因會導致復雜的綜合征，其精神表現(xiàn)包括SCZ 以及其他的精神障礙。COMT基因編碼2 種特征顯著的蛋白質亞型，細胞質中可溶性的COMT（Soluble cytoplasmic COMT，S-COMT）以及膜結合形式的COMT（membranebound COMT，MB-COMT）。MB-COMT 對多巴胺和去甲腎上腺素的親和力大約是S-COMT 的10 倍，這表明MB-COMT 更適合在大腦的生理水平上代謝包括多巴胺在內的兒茶酚胺。在SCZ 中，COMT 酶參與多巴胺等兒茶酚胺的降解過程。有證據(jù)表明，在SCZ 患者中，COMT啟動子區(qū)域甲基化增加，并且可以作為男性SCZ 患者外周生物標志物用于預測男性的SCZ 風險[24]。此外，SCZ的潛在風險被認為與COMT基因的甲基化程度降低有關[24-26]，COMT甲基化增加被認為會導致COMT基因表達降低[27]。人們認為，SCZ 患者的COMT 甲基化程度降低導致COMT 蛋白的表達增加，從而使其活性增加。COMT 活性增加后導致神經(jīng)遞質釋放后突觸DA 水平下降，這最終降低了突觸后神經(jīng)元的多巴胺能刺激，當這種情況發(fā)生在前額區(qū)時，可能導致SCZ 患者出現(xiàn)常見的執(zhí)行功能下降。

4.1.2 GAD1 基因谷氨酸脫羧酶1 基因（GAD1）編碼編碼谷氨酸脫羧酶，在人體中該酶負責催化L-谷氨酸產生γ-氨基丁酸。GABA 是一種主要的抑制性神經(jīng)元遞質，其抑制作用由GABAA 和GABAB 兩種受體介導，在神經(jīng)發(fā)育障礙中起關鍵作用，與癲癇、精神分裂癥、雙相情感障礙等多種神經(jīng)精神疾病有關[28]。國內有研究發(fā)現(xiàn)，SCZ患者啟動子DNA 甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）比值與單核苷酸多態(tài)性（SNPs）基因型顯著相關，揭示了SCZ 患者GABRB2 基因型依賴性甲基化和羥甲基化的改變[29-30]。此外，GAD1基因啟動子高甲基化與SCZ 患者基因型和蛋白表達不足有關，前扣帶回皮質的脂肪酸結合蛋白3（Fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABP3）調節(jié)谷氨酸脫羧酶（GAD1）啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)[31]。有研究表明，GABA 能基因如GAD1的下調是通過額葉皮層和其他腦區(qū)的高甲基化介導的，且這種高甲基化發(fā)生在基因的啟動子區(qū)域[32]。GAD1基因的表達改變被認為會導致工作記憶功能受損和皮質活動紊亂，這在SCZ 患者中很明顯[33]。以上證據(jù)表明SCZ 患者存在GAD1基因的啟動子區(qū)域甲基化失調。

4.2 BDNF 基因

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一種調節(jié)突觸傳遞和可塑性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元細胞的增殖、分化、成熟和存活中發(fā)揮作用。在大腦中，BDNF 是腦區(qū)神經(jīng)可塑性的關鍵中介，與早期生活事件和精神疾病都有關聯(lián)。有研究認為BDNF基因甲基化變化可能是早期生活逆境的一個生物標志物，因此也可能是成人精神疾病的一個生物標志物[34]。在SCZ 中，BDNF基因被認為是SCZ 發(fā)病機制的候選基因，與SCZ 的認知癥狀有關[35]，BDNF啟動子的CpG 位點DNA 甲基化與SCZ 認知功能修復有關[36]。此外，有研究表明，BDNF基因rs6265 甲基化與基因型相互作用，與SCZ 相關[37]。此前也有研究發(fā)現(xiàn)，SCZ 患者前額葉皮層和紋狀體BDNF 基因的DNA 甲基化狀態(tài)沒有改變[38]。導致研究結果不一致，可能是由于影響DNA 甲基化的共同因素所導致，如發(fā)病年齡、性別和藥物濫用等[36]。

4.3 RELN 基因

RELN基因被認為與SCZ 有關[39-41]。RELN基因編碼一種細胞外基質蛋白，該蛋白在大腦發(fā)育過程中參與細胞定位和神經(jīng)元遷移[42]。RELN基因的甲基化被認為是調節(jié)RELN表達的重要因素，被認為與精神疾病有關。SCZ 相關的藥物以及動物模型也能證實DNA 甲基轉移酶I（DNMT1）導致谷氨酸脫羧酶67（GAD67）、細胞外基質蛋白（RELN）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等基因高甲基化，導致基因表達減少，并觀察到類似的行為內表型[43-44]。此外，還發(fā)現(xiàn)SCZ 患者大腦中RELN基因表達減少還可能是SCZ 患者認知功能異常的基礎[45]，通過認知修復也可以可逆性的改變RELN啟動子CpG 甲基化水平，從而改變額葉以及額葉與顳葉的功能連接[36]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)SCZ 的不同階段，患者RELN基因的DNA 甲基水平不同，首次發(fā)作的SCZ 和慢性SCZ 的隊列研究中RELN 啟動子區(qū)域DNA 甲基化水平可能作為癥狀嚴重程度的生物標記物基因之一[46]。

4.4 其他基因

此外，還可有研究發(fā)現(xiàn)膽堿能受體煙堿性α7 基因（CHRNA7）參與SCZ 患者的認知內表型，有研究認為其啟動子甲基化會導致SCZ 患者中該基因表達降低[47]。Misiak 等[48]發(fā)現(xiàn)糖皮質激素受體基因（NR3C1）在首發(fā)SCZ 患者中甲基化水平顯著降低，SCZ 家族性高危人群中甲基化水平升高，且NR3C1基因的高甲基化水平與認知功能障礙有關。Liu L 等[49]發(fā)現(xiàn)，鹽皮質激素受體基因（NR3C2）DNA 甲基化與SCZ 的性別依賴有關，且具有性別特異性效應。此外Liu L 等[50]對SCZ 患者可溶性載體家族6-4 號基因（SLC6A4）的研究也發(fā)現(xiàn)SLC6A4的甲基化水平在女性明顯高于男性。SCZ 組SLC6A4甲基化水平與SCZ 顯著相關。以上這些研究結果表明多個基因DNA 甲基化與SCZ 密切相關。

5 小結

在SCZ 患者的DNA 甲基化研究中，發(fā)現(xiàn)諸如MAOA、COMT、GAD1、BDNF、RELN等諸多基因的DNA 甲基化與SCZ 有關。然而，受環(huán)境等諸多因素的影響，研究結果的一致性和可重復性仍較有限，需要對吸煙、飲酒、病程、用藥、年齡等諸多環(huán)境因素進行控制。目前的研究也已經(jīng)注意到這些局限性，可以使用SCZ 的動物模型來對上述局限性因素加以控制，開展新的動物模型驗證實驗。此外，要清楚地了解DNA 甲基化對SCZ 的影響，需要進一步了解SCZ 患者不同檢材中DNA 的甲基化差異。同時，也需要更進一步了解不同基因的甲基化在SCZ 患者中對基因表達調控的影響。展望進一步的研究，在分子水平以及細胞水平開展更多的功能驗證實驗以及細胞驗證試驗，同樣也是研究DNA 甲基化與SCZ 的重要環(huán)節(jié)。