參苓白術(shù)散對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠腸道菌群改變的作用機(jī)制研究

徐 琳 ，高開成 ，賈 杰 ，李煜陽 ，王華偉 ，況軼群 ，趙 昱

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖遺傳科，云南 昆明 650032）

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）俗稱冰毒，是一種人工化學(xué)合成的新型毒品，METH在中國濫用的人數(shù)則最多，占中國總體吸毒人員數(shù)量的55.2%，METH 濫用使吸食者產(chǎn)生興奮和致幻的癥狀[1-2]，并對(duì)吸食者的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷[3]，因此，METH濫用成為了醫(yī)療界和社會(huì)需迫切解決的問題[4]。

胃腸道疾病是METH 濫用吸食者顯著的臨床共發(fā)病之一，人體的腸道微生物種群在協(xié)助腸道消化和維持免疫平衡中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。METH 濫用破壞了吸食者的腸屏障系統(tǒng)，增加腸道通透性以及腸道炎癥[3,5-6]，使得吸食者的腸內(nèi)大分子、微生物種群以及產(chǎn)物可穿過腸屏障結(jié)構(gòu)，在循環(huán)系統(tǒng)介導(dǎo)下從腸道進(jìn)入大腦，引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)個(gè)體出現(xiàn)抑郁、焦慮、認(rèn)知功能障礙等精神癥狀[7]。

參苓白術(shù)散（Shen-ling-bai-zhu-san，SLBZS）是治療胃腸道疾病一種中成復(fù)方藥物，主要包括蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、甘草、山藥、黨參和大棗等成分。其在減輕患者的炎癥反應(yīng)，治療結(jié)腸道疾病具有明顯效果，并能夠改善患者的腸道菌群失衡[8]。本文通過研究SLBZS 干預(yù)METH 處理小鼠對(duì)小鼠為外周血免疫生化指標(biāo)以及腸道微生物種群的影響，探討SLBZS 對(duì)小鼠腸道疾病的改善機(jī)制，以期為廣大METH 濫用吸食者治療胃腸道疾病提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠（雄性），體重22-25 g；參苓白術(shù)散（同仁堂）；甲基苯丙胺（METH）；SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料；SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)用玉米芯墊料；生理鹽水；瓊脂糖；EZNA?糞便DNA 試劑盒；建庫試劑盒；測(cè)序試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及模型構(gòu)建將小鼠分為3 個(gè)組，分別為生理鹽水組（saline）、甲基苯丙胺組（METH）以及SLBZS 給藥甲基苯丙胺組（SLBZS+METH），用于外周血免疫生化指標(biāo)分析實(shí)驗(yàn)的小鼠模型每組5 只；用于16S rRNA 測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析的小鼠模型每組6 只。saline 組接受200 μL 的生理鹽水腹腔注射，METH 以及SLBZS+METH 組小鼠接受200 μL 的METH 腹腔注射，從2.5 mg/（kg·只）小鼠的劑量起始，1～7 d 每天注射1 次，8～21 d每天注射2 次，每次間隔8 h，每1 次注射相比前1 次遞增0.1 mg/kg 的劑量，腹腔注射持續(xù)到21 天。

1.2.2 SLBZS 給藥及樣本收集SLBZS 在成人中的常用劑量為6～9 g/d（標(biāo)準(zhǔn)體重按70 kg 來界定），根據(jù)《不同動(dòng)物間藥物劑量交換算法》（人鼠之間藥物劑量交換算法為9.1），小鼠體內(nèi)SLBZS 低劑量為0.86 g/kg，根據(jù)之前的研究報(bào)道，高劑量（最低劑量的4 倍）的SLBZS 對(duì)小鼠有更好的治療效果[9]，因此本研究SLBZS 針對(duì)METH 小鼠治療濃度為3.44 g/kg。在METH 腹腔注射小鼠21 d 后，將將SLBZS 在使用前將其溶解在無菌蒸餾水中，隨后對(duì)METH+SLBZS 組小鼠灌胃，每天1 次，每次體積為200 μL，連續(xù)灌胃7 d，隨后將小鼠從眼眶采血0.5 mL 至裝有EDTA-2K 的離心管中，迅速顛倒混勻后使用全自動(dòng)血常規(guī)檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠外周血免疫和生化指標(biāo)；將采血后的小鼠采取頸椎脫臼處死，收集小鼠的小腸部位的糞便樣本，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 小鼠糞便DNA 的提取及16S rRNA 測(cè)序?qū)⑿∈蠹S便樣本使用Omega 公司的EZNA?糞便DNA 試劑盒提取DNA，使用特定引物擴(kuò)增16S rRNA Bac 16S 基因：V3～V4 片段，擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)GeneTools 分析軟件v4.03.05.0（SynGene）以等密度比例混合，然后使用EZNA 凝膠提取試劑盒純化PCR混合產(chǎn)物。使用NEBNext? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?生成測(cè)序文庫，并添加索引代碼。使用賽默飛Qubit@2.0 熒光計(jì)和Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)評(píng)估文庫質(zhì)量。最后，該文庫在Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)上測(cè)序，產(chǎn)生250 bp 的雙端讀數(shù)，根據(jù)測(cè)序文庫分析腸道菌群信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)于小鼠外周血免疫和生化指標(biāo)的結(jié)果，組與組之間的比較分析通過Graphpad Prism 8.4.2 使用one-way ANOVA 分析完成，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠腸道微生物16S rRNA 測(cè)序結(jié)果通過有效數(shù)據(jù)的分類操作單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）聚類分析，再對(duì)所獲得的OTU 進(jìn)行Alpha多樣性的計(jì)算，結(jié)合秩和檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為閾值得出代表序列的物種注釋、物種信息和基于物種的豐度分布情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外周血免疫生化指標(biāo)

分析小鼠的外周血免疫生化指標(biāo)（表1），發(fā)現(xiàn)METH 組白細(xì)胞數(shù)量為3.31（2.42～5.29）×109/L，顯著低于saline 組6.22（5.73～8.57）和SLBZS+METH 組6.82（4.76～7.50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01 和P＜ 0.05）、中性粒細(xì)胞的數(shù)量在METH 組為0.67（0.44～0.92），高于saline 組0.25（0.16～0.32），P＜ 0.05 以 及SLBZS+METH組0.40（0.10～0.64），P＜ 0.01。METH 組淋巴細(xì)胞百分比89.60（85.00～90.90）以及淋巴細(xì)胞數(shù)量3.01（2.22～4.88），比saline 組的淋巴細(xì)胞百分比94.50（92.90～94.80）以及淋巴細(xì)胞數(shù)量5.86（5.24～8.11）顯著降低（P＜ 0.05），該結(jié)果顯示相比METH 組，SLBZS+METH 組小鼠提高了白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)量及百分比，降低了中性粒細(xì)胞的數(shù)量，其它諸如血細(xì)胞、血紅蛋白以及血小板相關(guān)生化指標(biāo)在3 組小鼠之間無明顯差異（P＞ 0.05），僅大型血小板比率在METH 組5.10（4.00～6.40）高于saline 組4.70（3.90～5.80），P＜ 0.05 以上結(jié)果說明SLBZS 增強(qiáng)METH 處理后小鼠的免疫力，降低小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

表1 小鼠外周血免疫和生化指標(biāo)的變化（中位數(shù)（范圍），n=5）Tab.1 The change of immune and biochemical indices in three mice groups（Medians with range，n=5）

2.2 小鼠腸道微生物種群組成

基于小鼠16S rRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，通過OTU 韋恩圖和柱狀圖分析saline、METH 以及SLBZS+METH 組OTU 組成的相似性以及重疊性（圖1A和1B），結(jié)果顯示saline、METH 及SLBZS+METH 組OTU 的總數(shù)量分別為7 347、7 021、7 353，各組獨(dú)有的OTU 的數(shù)量分別為6 128、5 908、6 058，METH 組OTU 總數(shù)和獨(dú)有OTU 數(shù)量相比SLBZS+ METH 組降低4.44%和2.48%，提示METH 處理后降低小鼠腸道微生物種群的豐度，通過SLBZS給藥后可一定程度地恢復(fù)小鼠腸道微生物種群數(shù)量。

圖1 小鼠腸道微生物種群組成示意圖Fig.1 The schematic diagram of intestinal microflora in mice

對(duì)物種信息的注釋（圖1 C 和表2），發(fā)現(xiàn)saline、SLBZS+METH 組共有微生物物種有7 種，包括葡萄球菌（Staphylococcus_sp）、乳桿菌（Lactobacillus_sp_C4I9）等；對(duì)于METH 組獨(dú)有微生物物種除了乳酸桿菌以外，也包括了致病菌如奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、芽孢桿菌（Bittarella_massiliensis）、乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。METH 組、SLBZS+METH 組共有微生物物種有14 種，包括促進(jìn)消化的雙歧桿菌（Bifidobacterium_sp_MC_8）、豚雙歧桿菌（Bifidobacterium_choerinum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus_acidophilus），抵御病原體感染分節(jié)絲狀菌（Candidatus_Arthromitus_sp_SFB-mouse-Japan）等。

表2 小鼠共有和獨(dú)有的腸道微生物物種的注釋Tab.2 The annotation of common and exclusive species of gut microflora in three mice groups

2.3 小鼠腸道微生物的多樣性

分析3 組小鼠腸道微生物種群的α 多樣性（表3），顯示METH 組的sobs、Chao1 和ACE 指數(shù)相比saline 和SLBZS+METH 組略有降低，但數(shù)據(jù)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；simpson、shannon指數(shù)在3 組小鼠沒有明顯的差異，該結(jié)果提示METH 組小鼠微生物種群的多樣性略有降低。

表3 小鼠腸道微生物的α 多樣性（）Tab.3 The alpha diversity of intestinal microflora in mice（）

表3 小鼠腸道微生物的α 多樣性（）Tab.3 The alpha diversity of intestinal microflora in mice（）

2.4 小鼠腸道微生物的功能

基于 16S rRNA 測(cè)序序列信息，使用PICRUSt 對(duì)小鼠腸道微生物群落功能進(jìn)行KEGG Pathway 的預(yù)測(cè)，由圖2（A-D）可知，METH 組小鼠主要降低了碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、輔因子和維生素的代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility）、細(xì)胞生長和死亡（Cell growth and death）、環(huán)境適應(yīng)（Environmental adaptation）、感染性疾病（Infectious diseases）等通路的豐度；通過SLBZS 給藥METH處理后小鼠后提高以上通路的豐度，其比saline組的小鼠略高。

3 討論

METH 濫用導(dǎo)致了吸食者腸道屏障出現(xiàn)破壞，增加腸道通透性以及腸道炎癥，從而引起腸道疾病的發(fā)生[3,10-12]，SLBZS 作為一種中成復(fù)方藥物，在增強(qiáng)體質(zhì)、提高免疫力、調(diào)節(jié)能量代謝和胃腸蠕動(dòng)方面具有重要功能[8-9]。本研究的小鼠血免疫生化指標(biāo)說明SLBZS 改善METH 引發(fā)的小鼠免疫力低下，并降低炎癥反應(yīng)，有報(bào)道稱SLBZS 給藥肺炎鏈球菌感染的小鼠降低了肺組織中性粒細(xì)胞的數(shù)量，抑制多種炎癥因子的表達(dá)[9,13]，闡明了SLBZS 在控制炎癥反應(yīng)具有顯著的作用。

METH 濫用可引起腸道微生物失調(diào)，降低益生菌的豐度，并提高致病微生物種群的豐度[14-15]。我們的結(jié)果提示METH 處理后降低了小鼠腸道微生物OTU 的數(shù)量，METH 組小鼠單獨(dú)出現(xiàn)幾種致病菌及條件致病菌如Proteus mirabilis、Bittarella_massiliensis、Acinetobacter calcoaceticus。研究顯示它們與腸道損傷具有緊密的聯(lián)系，如Proteus mirabilis的出現(xiàn)則與細(xì)菌感染后腸上皮細(xì)胞屏障功能受損有關(guān)[16]；Bittarella則與結(jié)腸炎、結(jié)直腸癌相關(guān)疾病中的致病，以及宿主抑郁癥的精神體征有關(guān)[17]。Acinetobacter具有較低的毒力，在潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸病狀態(tài)下升高[18]，而SLBZS 給藥后METH 處理小鼠腸道中上面描述的致病菌及條件致病菌消失，出現(xiàn)Bifidobacterium_sp_MC_8、Bifidobacterium_choerinum、Corynebacterium_casei等益生菌，對(duì)調(diào)節(jié)人體菌群平衡、降低腸黏膜損傷、抑制有害細(xì)菌具有良好的作用[19-20]。盡管我們結(jié)果顯示METH 組的小鼠降低了微生物種群的多樣性，但與saline 組、SLBZS+METH 組相比沒有明顯的差異。此外，我們小鼠腸道微生物進(jìn)行功能分析，顯示METH 處理后降低碳水化合物、輔因子和維生素、氨基酸相關(guān)的代謝功能，這些物質(zhì)為維持微生物正常的生長繁殖所需的營養(yǎng)元素。有研究顯示METH 依賴擾亂了人體正常的代謝穩(wěn)態(tài)，影響了丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝途徑，并降低了血清谷氨酸的水平[21]。SLBZS 可通過結(jié)腸發(fā)酵來改變高乳糖引起的腹瀉[22]，并能使微生物組的功能失調(diào)正?；?，上調(diào)能量代謝的途徑，減少氧化應(yīng)激和細(xì)菌發(fā)病機(jī)制[23]。

綜上所述，本研究證實(shí)了SLBZS 給藥METH處理后的小鼠能夠增強(qiáng)小鼠免疫力，降低炎癥反應(yīng)，減少小鼠的腸道微生物致病菌出現(xiàn)以及改善腸道基礎(chǔ)微生物代謝水平，為廣大毒品成癮患者的腸道疾病治療提供了一種潛在藥物，對(duì)改善患者的營養(yǎng)代謝與健康水平具有重要意義。