基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選宮頸鱗狀細(xì)胞癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物及驗(yàn)證

顏怡君 ，楊宏英 ，張紅平 ，李 政 ，賈 岳 ，趙 敏

（1）云南大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院婦科，云南 昆明 650118;3）醫(yī)務(wù)部，云南 昆明 650118）

宮頸癌是發(fā)病率較高的常見婦科癌癥之一，也是全球第四大導(dǎo)致女性死亡的癌癥[1]，僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌。宮頸癌發(fā)病逐漸年輕化[2]，而且容易發(fā)生淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移或蔓延，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增病例604 127 例，死亡人數(shù)超過 341 831 例[5]，其中超過90%的死亡病例發(fā)生在包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，從2015 年到2030 年，全世界宮頸癌的死亡率將增加約22%。對(duì)于包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家來說，宮頸癌仍是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。宮頸癌的主要病理類型85%以上是宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC），宮頸脫落細(xì)胞篩查、HPV 檢測(cè)和陰道鏡的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)CESC 癌前病變檢出率較高，同時(shí)隨著HPV 疫苗的普及，可有效降低患CESC 的風(fēng)險(xiǎn)，但昂貴的檢查費(fèi)用和宮頸癌預(yù)防的普及教育不足，導(dǎo)致包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家婦女未能廣泛獲得篩查和疫苗接種的機(jī)會(huì)，同時(shí)CESC 的早期癥狀并不典型以及現(xiàn)有診斷方法的局限性，因而超過50%的患者就診時(shí)已伴局部浸潤(rùn)或淋巴轉(zhuǎn)移，5 a 生存率不足17%。在當(dāng)今個(gè)性化醫(yī)療的時(shí)代，為實(shí)現(xiàn)對(duì)CESC 患者的精準(zhǔn)治療，手術(shù)后第一時(shí)間準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況尤為重要。因此，臨床上迫切需要尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CESC 患者預(yù)后的特異性標(biāo)志物，以便能通過個(gè)性化的治療和隨訪方案來改善患者預(yù)后。

miRNA 是一類具有調(diào)節(jié)功能的單鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸，通過與靶基因mRNA 的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合[6]，來降解某些特定基因或抑制其表達(dá)，從而影響蛋白水平的表達(dá)或功能。miRNA可以調(diào)節(jié)約 60% 的蛋白質(zhì)編碼基因，因此被稱為人類基因組的“主調(diào)節(jié)劑”[7]。miRNA 與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)[8]，已被鑒定為一種有效的腫瘤抑制因子/啟動(dòng)子（TsmiRs/Onco-miRs），具有成為生物標(biāo)志物的潛力。

本研究利用TCGA 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中CESC 的miRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法構(gòu)建了一個(gè)由4 個(gè)miRNAs（miR-505-5p、miR-142-3p、miR-532-5p、miR-218-1-3p）組成的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，在CESC 組織中驗(yàn)證后顯示miR-505-5p 在CESC 組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，同時(shí)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-505-5p 與CESC 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡密切相關(guān)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)并初步驗(yàn)證了TBL1XR1 作為miR-505-5p 靶基因的可能性，為miR-505-5p 作為CESC 的預(yù)后標(biāo)記物及探索CESC 發(fā)生的潛在分子機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選CESC 中差異表達(dá)的miRNAs

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載255 例CESC 組織和2 例癌旁正常組織的miRNAs 測(cè)序信息和相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，將miRNAs 表達(dá)量在癌與癌旁正常組織相差2 倍以上（|logFC∣ ＞ 1），校正后P值 ＜0.05（FDR ＜ 0.05）作為過濾條件，利用R 語(yǔ)言中的edgeR 包對(duì)miRNAs 的表達(dá)進(jìn)行差異分析，繪制差異表達(dá)miRNAs 的火山圖；利用pheatmap 包，選擇上調(diào)和下調(diào)最顯著的20 個(gè)miRNAs，繪制熱圖。

1.2 CESC 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建

對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 與生存時(shí)間的關(guān)系使用Kaplan-Meier 生存分析，根據(jù)P＜ 0.05，得到與生存相關(guān)的miRNAs，定義每個(gè)miRNA 的表達(dá)中位值，分為高低表達(dá)組，并繪制生存曲線。結(jié)合患者的生存時(shí)間，對(duì)上述得到與生存相關(guān)的miRNAs 進(jìn)行單因素COX 分析，找出預(yù)后相關(guān)的miRNAs。比較每個(gè)miRNA 與生存時(shí)間的關(guān)系，計(jì)算每個(gè)miRNA 與CESC 患者生存的風(fēng)險(xiǎn)比（hazardratio，HR）和P值，以P＜ 0.05 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出與CESC 患者預(yù)后顯著相關(guān)的miRNAs。單因素COX 分析發(fā)現(xiàn)5 個(gè)miRNAs 與生存顯著相關(guān)，進(jìn)一步對(duì)這5 個(gè)miRNAs 進(jìn)行多因素COX 分析，利用R 軟件中的caret 包對(duì)所有樣本等分為訓(xùn)練組（Train 組）和驗(yàn)證組（Test 組），對(duì)5 個(gè)miRNAs進(jìn)行隨機(jī)組合，最終發(fā)現(xiàn)4 個(gè)miRNAs 構(gòu)建的多因素COX 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型在驗(yàn)證組中準(zhǔn)確度最高。

1.3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型評(píng)價(jià)

根據(jù)Train 組構(gòu)建多因素Cox 回歸分析的結(jié)果及風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)（coef），計(jì)算基于miRNA 表達(dá)量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk score），計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk score）=風(fēng)險(xiǎn)基因1 的表達(dá)量×coef1＋風(fēng)險(xiǎn)基因2 的表達(dá)量×coef2+...＋風(fēng)險(xiǎn)基因n 的表達(dá)量×coefn（coef 為風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)）；對(duì)Train 組和Test組的每個(gè)樣品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，依據(jù)Train 組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將所有樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。利用R 軟件中survival 包分別繪制Train 組、Test 組及所有樣本的風(fēng)險(xiǎn)生存曲線，比較高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存差異；利用R 軟件中的survival ROC包繪制構(gòu)建模型的ROC 曲線，用于評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)患者預(yù)后的準(zhǔn)確性。

1.4 樣本收集

選取2020 年9 月至2021 年5 月在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院就診，且病理確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的患者作為研究對(duì)象，于術(shù)中留取宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織（癌旁組織距癌組織 ＞ 2 cm）各21 份，立即放入裝有RNA 保存溶液（RNA SAVE）的耐超低溫的凍存管中，后轉(zhuǎn)存到-80 ℃冰箱中保存。本研究獲得了昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽訂了知情同意書。

1.5 細(xì)胞、主要試劑與儀器

人子宮頸鱗癌細(xì)胞（SiHa）來自美國(guó)ATCC，由武漢普諾賽生命科技有限公司復(fù)蘇后保存使用。FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN，Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit、Ribo FECT CP Transfection Kit 轉(zhuǎn)染試劑盒、miR-505-5p 及U6 引物均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液購(gòu)自碧云天生物，CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)，凋亡試劑盒購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物，DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，TBL1XR1 抗體購(gòu)自北京Bioss，GAPDH 抗體購(gòu)自上海Abmart。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 RT-PCR 檢測(cè)CESC 組織中4 個(gè)miRNAs的表達(dá)將21 例CESC 組織和21 例癌旁組織分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，液氮研磨20 mg 組織后，采用TRIZOL 提取總RNA，并在ND-1000 型紫外分光光度計(jì)中測(cè)RNA 的濃度，A260/280 比值在1.8～2.0 者可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)RNA 濃度計(jì)算RT-PCR 反應(yīng)體系中所需總RNA 的體積。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將樣本中提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在羅氏LightCycle 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中按照RT-PCR 說明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共進(jìn)行40～45 個(gè)循環(huán)，采用U6 作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束，做Ct 值分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct法即相對(duì)表達(dá)量來表示，2-△△Ct==2^-[（Ct 實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）-（Ct 對(duì)照組目的基因-Ct 對(duì)照組內(nèi)參基因）]。

1.6.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將復(fù)蘇后的SiHa 細(xì)胞接種至含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、1%谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基中，并放入5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞接種至不同的孔板中（6 孔板、12 孔板、96 孔板），至細(xì)胞培養(yǎng)至融合度60%左右時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑盒Ribo FECT CP Transfection Kit 說明書轉(zhuǎn)染mimics NC及miR-505-5p mimics，6 孔板于轉(zhuǎn)染24 h 后用于PCR 檢測(cè)、WB 檢測(cè)及流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，12孔板用于做劃痕實(shí)驗(yàn)，96 孔板于轉(zhuǎn)染24 h 后進(jìn)行CCK8 檢測(cè)。以SiHa 細(xì)胞正常培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染mimics NC 作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-505-5p mimics作為過表達(dá)組，再次采用RT-PCR 對(duì)各組細(xì)胞中miR-505-5p 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，方法同1.6.1。

1.6.3 CCK8 法檢測(cè)3 組細(xì)胞增殖于轉(zhuǎn)染24 h后去除培養(yǎng)板中的細(xì)胞上清液，設(shè)置空白對(duì)照孔，每孔加入100 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，放回培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各孔的OD 值；按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力%=（實(shí)驗(yàn)孔OD-空白孔OD）/（對(duì)照孔OD-空白孔OD）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)于轉(zhuǎn)染后加入0.25%胰酶消化并收集3 組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105個(gè)/mL，接種至新的12 孔板中，每組3 孔重復(fù)。過夜培養(yǎng)至融合度95%時(shí)，用10 μL 槍頭橫豎劃兩條線，基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗一次，加入完全培養(yǎng)基，0 h、12 h、24 h、48 h 時(shí)間點(diǎn)拍照觀察，直至中間劃痕長(zhǎng)滿為止。

1.6.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3 組細(xì)胞的凋亡情況于轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說明書在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6.6 miR-505-5p 靶基因預(yù)測(cè)使用miRDB（http://www.mirdb.org/）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/download.php）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行miR-505-5p 的靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出的靶基因取交集，設(shè)置過濾條件為P＜ 0.01，進(jìn)行GO（GeneOntology，基因本體論）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）功能及通路的富集分析。通過生物信息學(xué)的方法分析靶基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)CESC 組織中的表達(dá)情況，為了進(jìn)一步縮小研究范圍，選擇TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CESC 組織和癌旁組織差異表達(dá)2 倍以上的靶基因作為研究對(duì)象。經(jīng)預(yù)測(cè)分析，TBL1XR1 可能是miR-505-5p 的靶基因。

1.6.7 RT-PCR 檢測(cè) miR-505-5p 對(duì) TBL1XR1RNA 表達(dá)水平的影響 取轉(zhuǎn)染mimics NC 及miR-505-5p mimics 24 h 后的2 組細(xì)胞，采用TRIZOL 提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后按照PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 作為內(nèi)參，GAPDH 上游引物（序列：TTGCCCTCAACGACCACTTT），GAPDH 下游引物（序列：TGGTCCAGGGGTCTTACTCC），TBL1XR1上游引物（序列：AAGTGCTGGAGTAGACAAG），TBL1XR1 下游引物（序列：AATGCTGGTGCT GAATGA），反應(yīng)體系包括Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上游引物 0.25 μL、下游引物0.25 μL、cDNA 模板1.0 μL、Nuclease-Free Water 3.5 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，進(jìn)行40～45 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，通過2-△△Ct法分析TBL1XR1 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.8 蛋白印跡法檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)TBL1XR1蛋白水平的影響取轉(zhuǎn)染mimics NC 及miR-505-5p mimics 24 h 后的2 組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液冰浴上裂解，離心后，使用超微量分光光度計(jì)，測(cè)量每個(gè)樣本蛋白濃度。根據(jù)各個(gè)樣本蛋白濃度，調(diào)整各樣本上樣體積，保證每個(gè)樣品的蛋白上樣量均為30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，反應(yīng)結(jié)束后，使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)至PVDF 膜，將PVDF 膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫封閉1 h，TBST 漂洗后加入TBL1XR1 抗體（1∶1 000）4℃冰箱過夜，取出后TBST 緩沖液漂洗，加入酶標(biāo)山羊抗小鼠抗體（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，ECL 顯色并平放在凝膠成像儀里采集圖像。每個(gè)樣本重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS26.0 軟件及Graph prism 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，3 組間比較采用單因素方差分析來比較組間差異，采用Pearson 或Spearman 相關(guān)法來檢驗(yàn)miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量與宮頸癌患者各臨床資料間的相關(guān)性。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA 的篩選

相比于正常組織，在CESC 組織中共有115個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（上調(diào)39 個(gè)，下調(diào)76 個(gè)），繪制火山圖（圖1），并選擇上調(diào)與下調(diào)最顯著的前20 個(gè)miRNAs 繪制熱圖（圖2）。圖中紅色表示該基因在CESC 組織中的表達(dá)較正常宮頸組織上調(diào)；綠色表示該基因在CESC 組織中的表達(dá)較正常宮頸組織下調(diào)。

圖1 CESC 中115 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs 火山圖Fig.1 Volcano map of 115 differentially expressed miRNAs in CESC heatmap

圖2 CESC 組織中差異表達(dá)最顯著的前20 個(gè)miRNAs 熱圖Fig.2 Heat map of the top 20 miRNAs with the most significant differential expression in CESC tissues

2.2 CESC 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建

分析115 個(gè)差異表達(dá)miRNAs 與生存時(shí)間的關(guān)系，使用Kaplan-Meier 生存分析，得到9 個(gè)與CESC 患者生存相關(guān)的miRNAs（P＜ 0.05）:hsa-miR-101-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-145-5p、hsamiR-200c-3p、hsa-miR-218-1-3p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-3613-5p，并分別繪制其生存曲線（圖3A-I），紅色代表miRNA 高表達(dá)組，藍(lán)色代表miRNA 低表達(dá)組。

圖3 9 個(gè)與CESC 患者生存相關(guān)miRNAs 的生存曲線Fig.3 Survival curves of 9 miRNAs related to CESC

對(duì)9 個(gè)與生存相關(guān)的miRNAs 進(jìn)行單因素及多因素Cox 回歸分析，最后得到由4 個(gè)miRNAs（hsa-miR-505-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-218-1-3p）組成的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型，該模型在驗(yàn)證組中準(zhǔn)確度最高，4 個(gè)miRNAs 的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)均小于零，提示這4 個(gè)miRNAs 是患者預(yù)后的保護(hù)因素，其表達(dá)量與生存時(shí)間正相關(guān)，見表1。

表1 多因素COX 回歸分析Tab.1 Multivariate COX regression analysis

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程的建立及生存曲線的繪制

根據(jù)上述多因素COX 分析得到的4 個(gè)miRNAs及風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程risk score=-0.41*hsa-miR-505-5p 表達(dá)量-0.48* hsa-miR-142-3p 表達(dá)量-0.81* hsa-miR-532-5p 表達(dá)量-0.48* hsa-miR-218-1-3p 表達(dá)量。根據(jù)此方程，計(jì)算每位宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的risk score 數(shù)值，根據(jù)Train 組risk score 數(shù)值的中位值，將CESC患者分為高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組，并將此模型運(yùn)用到Test 組和所有樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。利用R 軟件中的survival 包繪制風(fēng)險(xiǎn)生存曲線，比較高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存差異，紅色代表高風(fēng)險(xiǎn)，藍(lán)色代表低風(fēng)險(xiǎn)。Train 組、Test 組和所有樣本的生存曲線（圖4A、4B、4C）均顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜ 0.05），模型準(zhǔn)確。

圖4 Train 組、Test 組及所有樣本的生存曲線Fig.4 Survival curves of Train group，Test group and all samples

2.4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的評(píng)價(jià)

利用R 中的survival ROC 包分別繪制Train組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線（圖5A、B、C），用以評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性。Train 組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線顯示，模型預(yù)測(cè)CESC 患者預(yù)后的AUC 分別為0.859，0.758 及0.795，這表明模型具有良好的敏感性、特異性及一定預(yù)測(cè)能力。

圖5 Train 組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線Fig.5 ROC curves of Train group，Test group and all samples

2.5 CESC 患者腫瘤組織及癌旁組織中預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型中4 個(gè)miRNAs 的表達(dá)

CESC 患者腫瘤組織及癌旁組織中4 個(gè)miRNAs 的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示：miR-142-3p、miR-532-5p、miR-218-1-3p 在CESC 腫瘤組織及癌旁組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為癌組織0.253 5（0.107 1，0.926 8）和癌旁組織0.641 7（0.143 0，5.984 8），miR-505-5p 在CESC 患者癌組織中相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織（Z=-1.987，P=0.047），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6，因此選擇miR-505-5p 作為下一步研究對(duì)象。分析CESC 患者組織中miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量與患者各臨床資料的相關(guān)性，見表3，miR-505-5p 的相對(duì)表達(dá)量與患者的臨床分期和侵襲程度負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05，圖7）。

表3 miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量與各臨床資料相關(guān)性分析Tab.3 Correlation between the relative expression of miR-505-5p and clinical data

圖6 miR-505-5p 在CESC 組織及癌旁組織中的差異表達(dá)Fig.6 Differential expression of miR-505-5p in CESC tissues and adjacent tissues

圖7 miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量與臨床分期、宮頸侵襲程度的相關(guān)性Fig.7 Correlation between the relative expression of Mir-505-5p and clinical stage and cervical invasion degree

2.6 3 組SiHa 細(xì)胞中miR-505-5p 相對(duì)表達(dá)量比較

RT-PCR 檢測(cè)正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染mimics NC組以及轉(zhuǎn)染miR-505-5p mimics 組SiHa 細(xì)胞中miR-505-5p 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示miR-505-5p mimics 組中SiHa 細(xì)胞的miR-505-5p 的相對(duì)表達(dá)量高于正常培養(yǎng)組及mimics NC 組（P＜ 0.05），見圖8。

圖8 RT-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率Fig.8 Transfection efficiency verified by RT-PCR

2.7 miR-505-5p 抑制SiHa 細(xì)胞的活力、遷移及促進(jìn)凋亡

采用CCK8 實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)SiHa 細(xì)胞的活力、遷移及凋亡的影響，結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組及mimics NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-505-5p mimics 后SiHa 細(xì)胞活力（P＜ 0.05）及遷移能力下降，總細(xì)胞凋亡率增加（P＜ 0.05），見圖9-11，提示過表達(dá)miR-505-5p 抑制SiHa 細(xì)胞的活力、遷移能力及促進(jìn)凋亡。

圖9 CCK8 檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)SiHa 細(xì)胞增殖的影響Fig.9 Effect of miR-505-5p on the proliferation of SiHa cells detected by CCK8

圖10 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)SiHa 細(xì)胞遷移的影響（100×）Fig.10 Effect of miR-505-5p on the migration of SiHa cells detected by scratch test（100×）

圖11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)SiHa 細(xì)胞凋亡的影響Fig.11 Effect of miR-505-5p on apoptosis of SiHa cells detected by flow cytometry

2.8 miR-505-5p 靶基因的預(yù)測(cè)

通過miRDB、miRTarBase、TargetScan3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行miR-505-5p 的靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出的靶基因取交集，共有14 個(gè)共同靶基因，如圖12。為闡釋14 個(gè)靶基因的功能，進(jìn)行了GO 和KEGG 功能及通路的富集分析，結(jié)果顯示14 個(gè)靶基因主要參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路，見圖13。同時(shí)分析靶基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)CESC 組織中的表達(dá)狀態(tài)可知（如表4），TBL1XR1 在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量是癌旁組織2.046 倍，因此選擇TBL1XR1 作為目標(biāo)靶基因。

表4 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)CESC 組織中靶基因的表達(dá)Tab.4 Expression of target genes in CESC tissues from TCGA database

圖12 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-505-5p 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.12 Prediction results of miR-505-5p target genes in three databases

圖13 14 個(gè)靶基因GO 及KEGG 通路富集Fig.13 Enrichment of GO and KEGG pathways of 14 target genes

2.9 過表達(dá)miR-505-5p 抑制TBL1XR1 RNA及蛋白的表達(dá)

采用RT-PCR 及蛋白印跡法檢測(cè)miR-505-5p 對(duì)SiHa 細(xì)胞中TBL1XR1 RNA 及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與mimics NC 組相比，miR-505-5p mimics 組 中SiHa 細(xì) 胞TBL1XR1 的RNA 及 蛋白水平下降（圖14A、14B，P＜ 0.05）。說明miR-505-5p 可能抑制TBL1XR1 的表達(dá)。

圖14 轉(zhuǎn)染miR-505-5p 后細(xì)胞中TBL1XRI RNA 及蛋白水平的變化Fig.14 Changes of TBL1XRI RNA and protein levels in cells transfected with miR505-5p

3 討論

從正常組織到宮頸鱗狀細(xì)胞癌的復(fù)雜過程包括輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生、原位癌和浸潤(rùn)癌，是一個(gè)多階段、多基因調(diào)控異常的過程。miRNAs 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著原癌基因或抑癌基因的雙重角色[9]，可通過靶向調(diào)控各種信號(hào)通路中的靶基因來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵過程[10]。新的miRNAs 和靶基因的發(fā)現(xiàn)，將有助于宮頸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)和個(gè)性化治療方案的實(shí)施。

近年來，利用生物信息學(xué)分析法篩選腫瘤預(yù)后相關(guān)的miRNAs 及其靶基因已成為取代RNA 印跡分析法、微陣列芯片等傳統(tǒng)方法成為一種經(jīng)濟(jì)高效的分析方法，本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì) TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中255 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者組織及2 例癌旁正常組織相關(guān)miRNAs 進(jìn)行差異分析，共篩選出115 個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)在2 倍以上的miRNAs，結(jié)合患者臨床信息，通過Kaplan-Meier 生存分析、單因素COX 及多因素COX 回歸分析，構(gòu)建了由4 個(gè)miRNAs 組成的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，這4 個(gè)miRNA 分別是miR-505-5p、miR-142-3p、miR-532-5p 和miR-218-1-3p。然 而，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)CESC 組織樣本主要來源于美洲白人和黑人，不排除有人種遺傳的影響，因此本研究進(jìn)一步通過收集CESC 組織和癌旁組織來驗(yàn)證預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型中4 種miRNAs 的表達(dá)，選擇CESC 組織和癌旁組織中差異表達(dá)顯著的miR-505-5p 作為研究對(duì)象，同時(shí)探究miR-505-5p 對(duì)CESC 細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示miR-505-5p在CESC 患者癌組織中較癌旁組織低表達(dá)，并與CESC 患者臨床分期和侵襲程度呈負(fù)相關(guān)；細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，miR-505-5p 可抑制宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa 細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡，提示miR-505-5p 在CESC 中發(fā)揮抑癌作用。在既往的研究中，已經(jīng)報(bào)道m(xù)iR-505-5p 參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的相關(guān)細(xì)胞通路，并發(fā)揮抑癌作用。例如，在一項(xiàng)研究中[11]，miR-505-5p 在膀胱癌組織中顯著低表達(dá)，并通過靶向作用于Polo 樣激酶1（polo-like-kinase 1，PLK1）負(fù)向調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移；miR-505-5p[12]可抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并可靶向c-Myc 和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）來抑制Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)，從而阻止EMT 進(jìn)程。

為進(jìn)一步探究miR-505-5p 在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的潛在作用機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)分析法篩選出TBL1XR1 是miR-505-5p 的可能靶基因，人類TBL1XR1（轉(zhuǎn)導(dǎo)素 1X 連鎖受體蛋白1）基因位于染色體3q26.32，由18 個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度為208661bp。TBL1XR1 編碼的蛋白是組成核受體輔助抑制因子（NCoR）的核心成分，可通過調(diào)節(jié)維甲酸和甲狀腺激素受體的沉默介質(zhì)（SMRT）在轉(zhuǎn)錄活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。越來越多的研究表明，TBL1XR1 可受多種miRNAs 的調(diào)控，在腫瘤中表達(dá)上調(diào)并作為腫瘤啟動(dòng)子調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、腫瘤血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[14]。例如，miR-1 178-3p[15]在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，miR-1 178-3p過表達(dá)通過直接調(diào)控TBL1XR1/PI3K/Akt 通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在小鼠體內(nèi)降低腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。在肺癌[16]中，miR-34c-5p[16]可通過直接靶向TBL1XR1 抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究通過在SiHa 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-505-5p mimics 后發(fā)現(xiàn)，TBL1XR1 表達(dá)水平較miR-505-5p NC 組降低，Western blot 實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-505-5p 后TBL1XR1 蛋白水平降低，初步驗(yàn)證了miR-505-5p 與TBL1XR1 的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。既往研究證實(shí)TBL1XR1 可通過激活許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[17]來發(fā)揮作用，包括Notch23、Wnt-β-catenin、NF-κB 及PI3K/Akt 等，例如，在胰腺癌[18]中，TBL1XR1 的表達(dá)可激活c-Met/PI3K/Akt 信號(hào)通路以及促進(jìn)EMT 表型轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲；在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中[19]TBL1XR1 通過調(diào)節(jié)c-Met 介導(dǎo)的MEK 通路介導(dǎo)細(xì)胞的存活和增殖。TBL1XR1 作為促癌因子，其高表達(dá)被證實(shí)與許多腫瘤的不良預(yù)后和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，如胃癌[20]、原發(fā)性睪丸淋巴瘤[21]等。Wang 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TBL1XR1 的RNA 及蛋白表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞和組織中顯著上調(diào)，TBL1XR1 通過調(diào)節(jié)NF-κB 和 Wnt-β-catenin 通路來誘導(dǎo) EMT，與宮頸癌患者的臨床分期、生存時(shí)間和復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，并可作為宮頸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。然而目前尚未報(bào)道在宮頸癌中miR-505-5p 與TBL1XR1 的相互作用。

綜上所述，本研究初步探究了miR-505-5p在CESC 中可能通過靶向TBL1XR1 發(fā)揮抑癌作用，僅是為miR-505-5p 作為CESC 的預(yù)后標(biāo)記物提供一定的依據(jù)，同時(shí)為CESC 新的靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供思路。本研究仍存在許多不足之處，首先，本研究?jī)H在CESC 組織中驗(yàn)證了miR-505-5p 的表達(dá)，其是否能作為CESC 無創(chuàng)預(yù)后標(biāo)記物還應(yīng)在患者體液中驗(yàn)證，并可進(jìn)一步通過隨訪CESC 患者生存時(shí)間和狀態(tài)來證實(shí)。其次，miR-505-5p與TBLIXRI 的靶向關(guān)系也只是初步預(yù)測(cè)，還需通過熒光素酶報(bào)告基因、TBL1XR1 敲低回復(fù)等實(shí)驗(yàn)來證實(shí)二者的靶向關(guān)系。