云南省結(jié)核分枝桿菌分子特征和傳播相關(guān)因素分析

陳連勇，楊 星，茹浩浩，陳 濤，閆雙群，許 琳

（云南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所，云南 昆明 650022）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的的一種古老的慢性傳染性疾病，WHO 2021 年報(bào)告顯示[1]2020 年全球新發(fā)結(jié)核病患者990 萬例，結(jié)核病是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，嚴(yán)重危害了群眾身體健康和經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查方面顯示了獨(dú)特作用。通過對結(jié)核分枝桿菌的傳播動力學(xué)、來源和傳播的深入了解，增強(qiáng)了筆者對結(jié)核流行病學(xué)的理解，有助于有效預(yù)防和控制結(jié)核病。本研究采用Spoligotyping 和MIRU-VNTR技術(shù)，對來源于云南省耐藥監(jiān)測點(diǎn)的結(jié)核分枝桿菌開展基因分型，以了解云南省MTB 的分子特征、傳播及相關(guān)影響因素。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

846 株結(jié)核分枝桿菌為2016 年1 月至2019年12 月期間，云南省32 個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)從就診中發(fā)現(xiàn)的涂陽肺結(jié)核病患者，收集其痰標(biāo)本并分離培養(yǎng)后獲得。同時(shí)以國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv）作為對照。

1.2 表型藥物敏感性試驗(yàn)

采用比例法，具體試驗(yàn)操作參照人衛(wèi)版《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]，藥敏試驗(yàn)的6 種抗結(jié)核藥物分別為異煙肼（INH）、鏈霉素（SM）、利福平（RFP）、卡那霉素（KM）、氧氟沙星（OFX）和乙胺丁醇（EMB），培養(yǎng)基中藥物終濃度分別為0.2 μg/mL、4 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、2 μg/mL和2 μg/mL。同時(shí)以H37Rv 作為藥敏試驗(yàn)的對照進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 DNA 模板制備

用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)均勻刮取1 環(huán)改良羅氏培養(yǎng)基斜面上生長良好的新鮮菌株，重懸于300 μL TE 中，95℃恒溫金屬浴20 min 滅活，然后使用Lab-Aid 824 結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi 試劑盒及Lab-Aid 824 核酸提取儀，根據(jù)操作說明提取DNA 作為模板備用。

1.4 Spoligotyping 分型

采用熒光PCR 熔解曲線技術(shù)（McSpoligotyping）進(jìn)行Spoligotyping 基因分型，每個(gè)樣本分為3 個(gè)反應(yīng)體系（A/B/C），每個(gè)PCR 反應(yīng)體系為25 μL，分別含McSpoligotyping PCR Mix 19.75 μL（A/B/C），McSpoligotyping 酶混合液0.25 μL，DNA 模板5 μL。PCR 反應(yīng)分為兩個(gè)程序，（1）擴(kuò)增程序：50℃5 min→95℃ 10 min→（95℃ 15s→57℃ 15s→72℃15s）×50 個(gè)循環(huán)；（2）熔解程序：95℃ 1 min→35℃ 1 min→35℃～90℃ 以 0.04℃/s升溫速率的速度進(jìn)行熔解分析，且在此階段采集FAM、CY5、ROX 和HEX 通道熒光信號。判讀結(jié)果按順序錄入到Excel 表中。將Spoligotyping 結(jié)果按要求格式在線導(dǎo)入SITVITWEB 數(shù)據(jù)庫中（http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE）進(jìn)行比對，獲得Spoligotyping 分型結(jié)果等信息。

1.5 MIRU-VNTR 分型

采用國際通用的15 個(gè)MIRU-VNTR 位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌基因分型，15 個(gè)位點(diǎn)分別是：Mtub04、ETR-C、MIRU4、MIRU40、MIRU10、MIRU16、Mtub21、QUB-11b、ETR-A、Mtub30、MIRU26、MIRU31、Mtub39、QUB-26、和QUB-4156。每個(gè)PCR 反應(yīng)體系的體積為20 μL，分別含19 μL PCR Mix，1 μL DNA 模板。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 10 min→（94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃1 min）×35 個(gè)循環(huán)→72℃ 7 min。

取1.5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，在含1.2%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳。電壓85 V，120-160 分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下成像，根據(jù)遷移度判定擴(kuò)增目的片段的的相對分子量，確定各樣本各VNTR 位點(diǎn)重復(fù)單元的重復(fù)數(shù)并錄入到Excel 表格中。并以H37Rv 作為對照。

利用BioNumberics 5.0 軟件對Spoligotyping和MIRU-VNTR 的數(shù)字化試驗(yàn)結(jié)果開展基因分型聚類分析。具有完全相同基因型的菌株≥2 個(gè)即為成簇，用于估算近期傳播指數(shù)的成簇率采用RTIn-1 法[3]，即成簇率=（nc-c）/n，n 代表所有的結(jié)核分枝桿菌菌株數(shù)，c 代表結(jié)核分枝桿菌菌株成簇?cái)?shù)，nc指所有成簇的菌株數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，成簇危險(xiǎn)因素分析是將是否成簇作為因變量，將單因素分析中P＜ 0.2 的變量納入Logistic 回歸分析，計(jì)算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI），P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本情況

846 例病例中，來自云南省16 州（市）的32個(gè)耐藥監(jiān)測縣（區(qū)），16 個(gè)州（市）病例數(shù)最少的為21 例，最多的為125 例（表1）；男女比例為2.78:1；平均年齡（43.41±16.59）歲（最小年齡12 歲，最大年齡85 歲）；民族分布以漢族為主（513，60.64%），其次分別為彝族（104，12.29%）和傈僳族（44，5.20%）；小學(xué)及以下文化程度的患者的比例占57.80%；農(nóng)民患者占90.07%。初治肺結(jié)核患者占到總數(shù)的88.53%（749/846）。

表1 846 株結(jié)核分枝桿菌的州市分布情況Tab.1 Distributions of 846 Mycobacterium tuberculosis by prefecture

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

846 株結(jié)核分枝桿菌中，總耐藥率為20.80%。對INH、SM、RFP、KM、OFX、EMB 6 種抗結(jié)核藥物的耐藥率依次為10.28%、9.10%、6.38%、2.48%、2.25%和1.65%，其中耐多藥（MDR）菌株有32 株，MDR 率為3.78%。

2.3 Spoligotyping 分型結(jié)果

846 株結(jié)核分枝桿菌菌株中，北京基因型有539 株，占菌株總數(shù)的63.71%，為最大的一個(gè)基因家族。非北京基因型有307 株，占菌株數(shù)的36.29%，非北京基因型主要基因家族包括T1（20.69%，175/846）、T3（4.49%，38/846）和T2（2.36%，20/846），其次還有H3（0.83%，7/846）、T2-T3（0.59%，5/846）、T5（0.47%，4/846）、MANU2（0.47%，4/846）、EAI3-IND（0.12%，1/846）和CAS1_DELHI（0.12%，1/846）等基因家族（表2）。另有42 株（4.96%）在SITVITWEB 數(shù)據(jù)庫中不存在，為本研究中新發(fā)現(xiàn)或未定義的Spoligotyping分型結(jié)果。

表2 846 株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping 分型結(jié)果Tab.2 Spoligotype of 846 Mycobacterium tuberculosis Strains

各州（市）北京基因型所占比例范圍為43.55%～82.61%，其中，迪慶州的北京基因型占比最高，達(dá)82.61%（19/23），其次為曲靖市（78.22%）和楚雄州（76.25%）；北京基因型占比最低的為西雙版納州，為47.06%（24/51），各州市北京基因型分布存在明顯的地域分布差異（χ2=159.40，P＜ 0.001）。北京基因型和非北京基因型結(jié)核分枝桿菌與耐藥無關(guān)（P＜ 0.05）

2.4 MIRU-VNTR 結(jié)果

846 株結(jié)核分枝桿菌由2 個(gè)基因群組成，共627 個(gè)基因型，包括101 個(gè)基因簇和526 個(gè)獨(dú)立基因型（圖1），101 個(gè)基因簇中，成簇菌株數(shù)為2～18 株，成簇率為25.89%。根據(jù)與Spoligotyping結(jié)果比對，第Ⅰ群均為北京基因型，539 株含379 個(gè)基因型，包括71 個(gè)基因簇和308 個(gè)獨(dú)立基因型，成簇率為29.68%。第Ⅱ群共307 株菌，為非北京基因型，占總菌株數(shù)的36.29%，含248個(gè)基因型共307 株，其中218 個(gè)獨(dú)立基因型，其余89 株成簇的菌株分為30 個(gè)基因簇，成簇率為19.22%。Ⅰ群與Ⅱ群菌株成簇率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（29.68 % vs 19.22%，P＜ 0.01）。

圖1 846 株結(jié)核分枝桿菌的15 MIRU-VNTR 位點(diǎn)聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of 15 MIRU-VNTR loci in 846 strains of Mycobacterium tuberculosis

2.5 結(jié)核近期傳播危險(xiǎn)因素分析

以結(jié)核分枝桿菌是否成簇當(dāng)作因變量，將結(jié)核病患者性別、年齡、民族、來源、耐藥情況、治療史和基因型等因素納入單因素分析（表3），然后以P＜ 0.2 作為納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Logistic 多元回歸分析，結(jié)果顯示，北京基因型及INH 敏感是結(jié)核分枝桿菌成簇的危險(xiǎn)因素，與非北京基因型相比，北京基因型成簇的風(fēng)險(xiǎn)是其1.861 倍（P＜ 0.05，95%CI1.376～2.516）；而INH 敏感菌株成簇風(fēng)險(xiǎn)是耐藥菌株的1.869 倍（P＜ 0.05，95%CI1.129～3.094），見表4。

表3 結(jié)核分枝桿菌成簇影響的單因素分析Tab.3 Univariate Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

表4 結(jié)核分枝桿菌成簇影響的多因素分析Tab.4 Multifactorial Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

3 討論

本研究對來自云南省的846 株結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用Spoligotyping 和15 個(gè)MIRU-VNTR 位點(diǎn)的基因分型方法進(jìn)行了分子流行病學(xué)特征分析，結(jié)果顯示，我省結(jié)核分枝桿菌北京基因型的比例為63.71%，是我省結(jié)核分枝桿菌的主要流行株，結(jié)核分枝桿菌北京基因型比例略高于既往研究結(jié)果（55.7%）[4]，與62.2%的全國平均水平及周邊省份如四川（55.7%）、廣西（60.48%）、貴州（55.13%）相近[5-7]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于江西（78.2%）、江蘇（81.1%）等東部省份[8-9]及甘肅（87.58%）、北京（83.3%）、河南（89.8%）等北部省份[10-12]，同時(shí)，我省各州、市來源菌株北京基因型比例差異較大（43.55%～82.61%），表明我省結(jié)核分枝桿菌北京基因型分布受地域影響較大。本研究還對基因型與耐藥的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示北京基因型與結(jié)核分枝桿菌對各藥物的耐藥性以及MDR 均無相關(guān)性，這與Luo D 等[8,13-14]研究結(jié)果一致，也有研究表明北京基因型結(jié)核分枝桿菌與耐藥特別是耐多藥相關(guān)[5,15-17]，這些差異的產(chǎn)生可能是由于地理、社會經(jīng)濟(jì)條件、HIV 或糖尿病等因素引起的[10]。

非北京基因型中，以T 家族為主（T1、T3 和T2 等），其次為MANU、H、LAM 和X 等基因型、這與全國其他地方的分布類似，但本研究中還發(fā)現(xiàn)了CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等基因型以及43株（5.08%）的未定義或新的Spoligotyping 基因型。EAI 是東南亞和南亞最常見的家族，也流行于北歐，并可能與輸入病例相關(guān)，在緬甸，EAI 基因型比例僅次于北京基因型[18]，而在國內(nèi)僅見廣西有報(bào)道[7]；CAS 主要存在于南亞、西亞及非洲東部地區(qū)[19]，我國少見，絕大部分分布于北方地區(qū)[5]。而CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等我省既往未見報(bào)道，本次研究發(fā)現(xiàn)的這些基因型這些菌株均來源于邊境州、市，這可能與我省地處西南邊陲，與緬甸、越南和老撾接壤，且與境外無天然屏障，邊貿(mào)及人員交流頻繁，結(jié)核分枝桿菌基因型也表現(xiàn)為高度多態(tài)性。

本研究使用15 個(gè)MIRU-VNTR 位點(diǎn)對云南省的結(jié)核分枝桿菌基因分型，成簇率為25.89%，說明在云南省存在結(jié)核分枝桿菌的近期傳播，因此必須采取措施主動發(fā)現(xiàn)患者并實(shí)行切實(shí)有效的治療管理措施，控制結(jié)核病的近期傳播，并對結(jié)核病患者的密切接觸者進(jìn)行篩查，而云南省近些年也加大了經(jīng)費(fèi)投資力度，推廣使用新診斷技術(shù)、建立示范區(qū)等措施，提高患者的發(fā)現(xiàn)和治療管理，這將有效地發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者并控制結(jié)核病的近期傳播。本研究對結(jié)核分枝桿菌成簇相關(guān)影響因素分析結(jié)果顯示北京基因型及對INH 敏感結(jié)核分枝桿菌更容易成簇，這與既往研究一致[8,11,13,17,20]，這可能與北京基因型具有高毒力以及卡介苗接種等因素有關(guān)，本研究中北京基因型結(jié)核分枝桿菌成簇率顯著高于非北京基因型，這也說明了北京基因型具有更強(qiáng)的毒力和傳播能力。有研究表明耐藥結(jié)核病病人比敏感病例更容易成簇[15,17,20]，認(rèn)為耐藥性導(dǎo)致治療失敗并導(dǎo)致患者長期保持感染性，因而更容易成簇，而在本研究中，異煙肼耐藥菌株比異煙肼敏感菌株更不容易成簇，這與Durmaz 等[21-22]研究結(jié)果一致，有動物模型顯示異煙肼耐藥可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的毒力下降[22]，推測異煙肼耐藥菌株在人群中產(chǎn)生繼發(fā)病例的可能性下降，也有研究表明，成簇和不成簇的異煙肼耐藥菌株在異煙肼耐藥基因-katG 基因中的特定突變位點(diǎn)的發(fā)生率不同，傳播能力存在差異[22]，具體原因還有待今后的進(jìn)一步研究。

綜上所述，云南省結(jié)核分枝桿菌基因型呈高度多態(tài)性，但北京基因型仍是主要流行株，云南省存在結(jié)核病的近期傳播，北京基因型和INH 敏感是近期傳播的影響因素，因此必須采取各種措施主動發(fā)現(xiàn)傳染源、規(guī)范治療和管理，使其不再具有傳染性，并及時(shí)篩查活動性結(jié)核病例的密切接觸者，以控制結(jié)核的傳播。