大鯢皮膠原蛋白的提取及特性研究

周艷華 郟修齊 王建文 羅慶華

大鯢，又稱娃娃魚，為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，野生大鯢禁止捕殺。隨著養(yǎng)殖技術(shù)不斷推進(jìn)，大鯢養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，目前已達(dá)到較大規(guī)模。大鯢養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也催生了一批專門從事大鯢加工的企業(yè)，并在大鯢加工過程中產(chǎn)生了大量加工副產(chǎn)物——大鯢皮。大鯢皮富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，特別是其含有的膠原蛋白應(yīng)用范圍廣泛，包括食品、化妝品、生物醫(yī)藥等，因此研究大鯢皮的開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)有的研究一般采用新鮮濕態(tài)的大鯢皮來提取膠原蛋白，但濕態(tài)的大鯢皮容易滋生細(xì)菌等微生物，所以作者在前期研究工作中創(chuàng)新采用干制大鯢皮粉提取膠原蛋白。大鯢皮經(jīng)干燥粉碎后，在提取過程中提高了物料接觸的比表面積，提取率更高，還可實(shí)現(xiàn)異地加工，降低物流成本等，為大鯢皮膠原蛋白的開發(fā)利用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文在此基礎(chǔ)上研究了大鯢皮膠原蛋白的提取及特性研究，以拓寬大鯢皮的開發(fā)利用領(lǐng)域。

一、材料與試劑

大鯢皮，張家界金鯢生物股份有限公司；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、小牛鍵Ⅰ型膠原，美國Sigma公司；透析袋，上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（1200U/g）、乙酸、氫氧化鈉、正丁醇、溴化鉀、氯胺T、甲醛等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

二、儀器與設(shè)備

AR-2140電子分析天平，美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；1-4LD型冷凍干燥機(jī)，德國ALPHA公司；Avanti J-26XP冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；pHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；DK-98-11A恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；FYL-C020E料理機(jī)，九陽股份有限公司；FW100萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；NEXUS-470傅立葉紅外光譜儀，Nicolet Instrument Corp；UV1800紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

三、實(shí)驗(yàn)與方法

1.干制大鯢皮膠原蛋白的提取。參照《干制大鯢皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化》（周艷華等）的方法提取干制大鯢皮中的膠原蛋白，提取純化后的膠原蛋白呈白色海綿狀。

2.大鯢皮膠原蛋白的圓二色譜（CD）分析。準(zhǔn)確稱取一定量的大鯢皮膠原蛋白凍干品，以0.5mol/L的乙酸溶液為溶劑，將大鯢皮膠原蛋白配制成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的蛋白溶液。將適量蛋白溶液注入光徑為1mm的石英池中，在注入過程中要防止蛋白溶液產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生氣泡就要重新注入。采用圓二色譜儀（型號(hào)為JASCO J-810）在波長190-250nm處對蛋白溶液進(jìn)行掃描，重復(fù)掃描3次，掃描速率為100nm/min。

3.大鯢皮膠原蛋白的氨基酸組成分析。取一定量的大鯢皮膠原蛋白樣品，在減壓充氮的條件下，采用6mol/L的HCl對蛋白樣品進(jìn)行水解，水解溫度為110℃，水解時(shí)間為24h。水解完全后，使用氨基酸自動(dòng)分析儀對蛋白樣品進(jìn)行檢測。

4.大鯢皮膠原蛋白的吸水性測定。準(zhǔn)確稱取1.000g大鯢皮膠原蛋白樣品，均勻平鋪于干燥并已預(yù)先稱重的培養(yǎng)皿中，再將其置于溫度40℃、相對濕度67%的恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行測定。每隔6h測量一次培養(yǎng)皿的質(zhì)量并記錄為m1，直到培養(yǎng)皿的質(zhì)量不再增加時(shí)停止測定，此時(shí)培養(yǎng)皿的質(zhì)量為m2。吸水性公式如下：

吸水性（g/g）=

5.大鯢皮膠原蛋白的保水性測定。準(zhǔn)確量取0.5%的大鯢皮膠原蛋白溶液1mL于培養(yǎng)皿中，搖勻，置于溫度40℃、相對濕度19%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，每隔10min測量一次大鯢皮膠原蛋白溶液的水分殘存率。同時(shí)采用明膠進(jìn)行對比試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法與大鯢皮膠原蛋白溶液相同。

6.大鯢皮膠原蛋白的乳化能力測定。本試驗(yàn)采用濁度法測定大鯢皮膠原蛋白的乳化能力，操作過程參考《可溶性雞蛋殼膜蛋白與多肽的制備及其抗氧化活性的研究》（周艷華）。

7.大鯢皮膠原蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性測定。參照《可溶性雞蛋殼膜蛋白與多肽的制備及其抗氧化活性的研究》（周艷華），測定大鯢皮膠原蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。

四、結(jié)果與分析

1.大鯢皮膠原蛋白的純化試驗(yàn)結(jié)果。將提取所得的大鯢皮膠原蛋白溶液，經(jīng)等電點(diǎn)沉淀，透析，取出。然后利用聚乙二醇對其進(jìn)行濃縮，最后經(jīng)過冷凍干燥得到大鯢皮膠原蛋白。大鯢皮膠原蛋白呈絮狀，顏色潔白，屬于纖維蛋白。

2.圓二色譜分析。大鯢皮膠原蛋白的圓二色譜（CD）如圖1所示。由圖1可知，大鯢皮膠原蛋白在波長196nm左右處有1負(fù)峰，與膠原蛋白的負(fù)峰一般出現(xiàn)在波長198nm左右相一致，表明提取得到的大鯢皮膠原蛋白具有典型的膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的CD圖譜特征峰型。因此，CD圖譜也進(jìn)一步表明了用此法制備的大鯢皮膠原蛋白具有較完整的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3.大鯢皮膠原蛋白的氨基酸組成分析結(jié)果。大鯢皮膠原蛋白的氨基酸組成測定結(jié)果如表1所示。由表1可知，大鯢皮膠原蛋白中的甘氨酸含量最高，約占總氨基酸的1/3，與膠原蛋白的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)Cly-X-Y重復(fù)排列這一結(jié)構(gòu)特征相一致，說明從大鯢皮中提取得到的蛋白質(zhì)是膠原蛋白。除了甘氨酸之外，脯氨酸的含量也較高，達(dá)到了33.92%，再次印證了所提取得到的蛋白質(zhì)為膠原蛋白。此外，大鯢皮膠原蛋白中還含有組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸等具有明顯抗氧化活性的功能性氨基酸，由此可以推測大鯢皮膠原蛋白可能具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

4.大鯢皮膠原蛋白的吸水性測定結(jié)果。吸水性是指樣品吸附或攝取水分的能力，一般用每單位樣品吸附水分的克數(shù)來表示。本試驗(yàn)將大鯢皮膠原蛋白置于溫度40℃、相對濕度67%的條件下，測得大鯢皮膠原蛋白的吸水性為0.072g/g，而明膠的吸水性為0.050g/g，表明大鯢皮膠原蛋白具有較好的吸水性。

5.大鯢皮膠原蛋白的保水性測定結(jié)果。保水性是指樣品保持水分的能力，一般用水分殘存率來表示。大鯢皮膠原蛋白和明膠在溫度40℃、相對濕度19%條件下測得的不同時(shí)間段的水分殘存率如圖2所示，由圖2可知，大鯢皮膠原蛋白在一定條件下具有較強(qiáng)的保水性，且其效果優(yōu)于明膠。

圖2：大鯢皮膠原蛋白及明膠水分殘存率曲線

6.大鯢皮膠原蛋白的乳化能力測定結(jié)果。乳化性是指樣品將油和水兩種不同物質(zhì)結(jié)合在一起形成乳狀液的能力，溶液的pH、溫度和蛋白質(zhì)的濃度等都會(huì)影響蛋白質(zhì)的乳化性。本試驗(yàn)測得大鯢皮膠原蛋白的乳化性EAI為7.86m2/g pro，而明膠為6.50m2/g pro，表明大鯢皮膠原蛋白具有較好的吸水性能，原因可能是大鯢皮膠原蛋白的相對分子質(zhì)量較大，有利于其在油-水界面的擴(kuò)散和吸附。

7.大鯢皮膠原蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性測定結(jié)果。起泡性是指樣品經(jīng)攪打后產(chǎn)生泡沫的能力，泡沫穩(wěn)定性則是指攪打停止后在不同時(shí)間內(nèi)泡沫保持穩(wěn)定的能力。大鯢皮膠原蛋白和明膠的起泡性與泡沫穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，大鯢皮膠原蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于明膠，在蛋糕等糕點(diǎn)食品中具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖3：大鯢皮膠原蛋白和明膠的起泡性與泡沫穩(wěn)定性

綜上，為拓寬大鯢皮的開發(fā)利用領(lǐng)域，本文研究了大鯢皮膠原蛋白的提取技術(shù)，并對其特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，大鯢皮膠原蛋白保留了較完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，通過測定其吸水性、保水性、乳化性、起泡性等特性，結(jié)果均顯示良好，表明其在食品、生物醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有較大的開發(fā)價(jià)值。

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（21C1587）；湖南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（2022ZYQ044）。

作者簡介：周艷華（1983-），女，漢族，湖南汝城人，高級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)榇篥F生物活性物質(zhì)。

*通信作者：羅慶華（1970-），女，白族，湖南耒陽人，教授，研究方向?yàn)榇篥F精深加工技術(shù)。