HPLC-QTOF測定保健食品及中成藥 中非法添加降糖類化學藥物的方法研究

朱潔 施芬 舒展 鄭籃君

近年來，2型糖尿病患者人數(shù)在我國有顯著上升趨勢，而降血糖類保健食品或中成藥作為重要的輔助治療手段，卻時有被檢出非法添加降糖藥物的情況。目前用于檢測非法添加降糖藥物的常見技術有薄層色譜、近紅外光譜、表面增強拉曼光譜、液相色譜、電噴霧離子遷移譜、核磁共振法和液相色譜-質譜聯(lián)用等，而高效液相色譜四級桿飛行時間質譜（HPLC-QTOF）聯(lián)用技術可通過多級質譜聯(lián)用技術提供分子離子峰的碎片信息，并能對未知化合物進行篩查和確證，特別適用于對保健食品及中成藥等復雜體系的研究，能夠有效降低非法添加漏檢的可能性。本文采用HPLC-QTOF檢測技術，在原國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的三個篩查非法添加降糖藥物批準件（2009029、2011008、2013001）的基礎上，制定了篩查保健食品和中成藥中18種非法添加降糖藥物的定性定量檢測方法。

一、材料

1.儀器。Direct-Q5UV超純水系統(tǒng)，密理博公司；Mettler XS205DU電子天平，梅特勒公司；安捷倫6530液相色譜-三重四極桿飛行時間質譜、Mass Hunter軟件，Agilent公司；KQ-250DE超聲儀，昆山市超聲儀有限公司。

2.對照品。13種降糖物質混合對照溶液（二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、羅格列酮、吡格列酮、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齊特、格列波脲、格列苯脲、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮，濃度均為100?g/mL），購自壇墨質檢標準物質中心；達格列凈、卡格列凈，購自壇墨質檢標準物質中心；那格列奈、維格列汀、阿卡波糖，購自中國食品藥品檢定研究院。

3.試劑。甲醇、乙腈（色譜純），美國霍尼韋爾公司；冰醋酸（色譜純），德國Merck公司。

二、條件

1.對照品溶液制備。分別精準稱取達格列凈、那格列奈、卡格列凈、維格列汀、阿卡波糖對照品適量，用50%甲醇溶解稀釋，制成5種混合對照品溶液（100?g/mL）。分別精密量取13種混合對照溶液（100?g/mL）和上述5種混合對照品溶液（100?g/mL）各2mL于20mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋定容，制成混合對照儲備液（10?g/mL）。

2.樣品溶液制備。待測樣品為保健食品及中成藥，共20批，均為市場抽檢樣品。精密稱取研細的待測樣品1g，置于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液，超聲提取15min，冷卻至室溫后，用50%甲醇溶液稀釋定容，搖勻，用0.22?m濾膜過濾后備用，必要時需根據(jù)檢測過程中非法添加物的濃度調整樣品稀釋倍數(shù)。

3.色譜條件。色譜柱為安捷倫EC-C18柱（150mm×3.1mm，2.7?m），柱溫40℃；流動相A為0.1%乙酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序為：0-15min，A：90%-60%；15-25min，A：60%-10%；25-30min，A：10%；30-31min，A：10%-90%；31-40min，A：90%。

4.質譜條件。ESI離子源，霧化器（N2）為241kPa，干燥氣（N2）流速為12L/min，溫度為200℃，毛細管電壓為3.5kV，碎裂電壓為160V。采集模式：正離子模式，掃描范圍為100-1000，二級質譜碰撞池能量為20eV。

三、實驗方法學考察

1.精密度。取混合對照品溶液（1?g/mL），連續(xù)進樣5次，根據(jù)峰面積計算精密度。結果顯示，各化合物峰面積RSD為0.53%-2.69%（n=5），表明精密度良好。

2.線性關系與檢出限。取混合對照品儲備液，分別加入50%甲醇稀釋配制成質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10?g/mL的系列標準溶液，各成分從中選取5個濃度，以質量濃度為橫坐標（X，?g/mL）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。結果表明，各成分在一定濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)r均大于0.99（表1）。

3.穩(wěn)定性。取混合對照品溶液（1?g/mL），在放置0h、6h、12h、24h后分別測定各化合物峰面積。結果顯示，18種化合物的峰面積RSD為1.05%-3.23%，表明各化合物在24h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

4.加樣回收率。稱取未檢出降糖類藥物的陰性片劑粉末1.0g，分別精密加入18種混合對照品溶液（10?g/mL）0.8mL、1.0mL、1.2mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇溶液，超聲溶解，稀釋至刻度。每個濃度制備3份平行樣品，測定各化合物峰面積并計算回收率及RSD（%），結果詳見表2。

5.樣品測定。對抽檢的20批保健食品及中成藥樣品進行測定，有3批樣品中檢出了非法添加降糖類藥物，添加藥物種類為格列本脲、鹽酸二甲雙胍，其中有2批樣品同時檢出格列本脲（450.5mg/kg、602.7mg/kg）、鹽酸二甲雙胍（70.3mg/kg、100.2mg/kg）兩種非法添加物，1批樣品檢出鹽酸二甲雙胍（60.5mg/kg）。降糖藥物非法添加含量較高，添加劑量隨意且不確定，會對消費者健康產(chǎn)生較大危害。

四、討論

1.流動相系統(tǒng)優(yōu)化。通過文獻參考及預實驗，分別考察水-甲醇、水-乙腈、0.1%乙酸溶液-乙腈、0.01mol/L乙酸銨-甲醇流動相系統(tǒng)對化合物分離情況及質譜響應值的影響，最終選取0.1%乙酸溶液-乙腈作為流動相，可將18種化合物有效分離，也可獲得較高質譜響應。18種化合物總離子流色譜如圖1所示。

2.色譜柱選擇。分別選擇安捷倫EC-C18色譜柱、Ultimate XB-C18色譜柱、XBridge C18色譜柱進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)采用安捷倫EC-C18色譜柱可以取得滿意的峰形、分離度和響應情況。

綜上，本文建立的方法前處理操作簡單，結果準確，且能將3個批準件篩查范圍從13種化合物擴大到18種化合物，并對色譜條件等進行優(yōu)化，縮短了檢測時間，提高了檢測效率，可應用于降糖類保健食品和中成藥非法添加的日常監(jiān)督檢驗。

基金項目：金華市科技計劃公益類項目“基于HPLC-QTOF技術降糖類藥物數(shù)據(jù)庫的構建及其在食品藥品非法添加中研究”（2020-4-094）。

作者簡介：朱潔（1983-），女，漢族，浙江金華人，講師，碩士研究生，研究方向為藥物分析教學。

*通信作者：舒展（1984-），男，漢族，浙江金華人，主管藥師，碩士研究生，研究方向為藥物分析。