乳腺癌患者婆羅雙樹樣基因4表達(dá)情況及PTEN/AKT/mTOR通路對乳腺癌阿霉素耐藥性作用研究

王燕艷, 王 梅, 黃琰菁, 鄭佳璇, 鄭垂志

海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院)1.腫瘤內(nèi)科;2.乳腺外科;3.病理科,海南 ?？?570100

乳腺癌為女性高發(fā)惡性腫瘤,伴隨著多種基因及蛋白表達(dá)的改變。有研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌早期患者已經(jīng)出現(xiàn)婆羅雙樹樣基因4(sal-like 4,SALL4)表達(dá)升高,SALL4會參與乳腺癌的腫瘤增殖、腫瘤細(xì)胞間粘附等多種生物學(xué)行為[1]。乳腺癌對化療較為敏感,化療是乳腺癌的重要治療手段之一,但耐藥問題會使化療效果大打折扣,提高乳腺癌患者的化療敏感性成為當(dāng)前研究熱點[2-3]。以阿霉素為主的蒽環(huán)類藥物是乳腺癌的常用化療方案,從分子水平分析乳腺癌對阿霉素耐藥的機制可為乳腺癌新的治療靶點提供參考。SALL4與乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性有關(guān),而PTEN/AKT/mTOR通路被證實是與乳腺癌耐藥性有關(guān)的通路[4]。本研究旨在探討乳腺癌患者SALL4的表達(dá)情況,以及PTEN/AKT/mTOR通路對乳腺癌阿霉素耐藥性的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取海南省人民醫(yī)院自2010年6月至2022年6月收治的90例乳腺癌手術(shù)患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性乳腺癌;術(shù)前未接受放療、化療、內(nèi)分泌治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):伴其他惡性腫瘤;伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊呔鶠榕?年齡27～63歲,平均年齡(50.46±6.17)歲;腫瘤最大徑≤5 cm 52例,最大徑>5 cm 38例;病理類型為浸潤性導(dǎo)管癌72例,其他18例;組織學(xué)分級Ⅰ級12例,Ⅱ級61例,Ⅲ級17例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例;雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性50例,陰性40例;人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)陽性36例,陰性54例;孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽性44例,陰性46例;Ki67<14% 16例,Ki67≥14% 74例。提取50～100 mg癌組織及癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm)置于EP管中,立即放入液氮罐并置于-80℃下保存待測?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SALL4表達(dá)檢測 (1)免疫組織化學(xué)法。乳腺癌組織石蠟切片,厚度4 μm。60℃下烤1 h,依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ等洗脫15 min,無水乙醇Ⅱ 5 min,95%、85%、75%乙醇、蒸餾水分別2 min。微波加熱抗原修復(fù)液,放入切片,加熱10 min。PBS浸泡5 min,3次。吸水,3%H2O2孵育15 min,PBS浸泡。滴加山羊血清并孵育15 min。一抗用PBS稀釋50倍,PBS浸泡。二抗用PBS稀釋200倍,孵育、浸泡。滴加HRP標(biāo)記親和素,孵育、浸泡。等量混合DAB顯色試劑A、B,加100 μl顯色試劑,待顏色變深時終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min,流水沖洗返藍(lán)5 min。切片依次浸入75%、85%、95%乙醇等洗脫、封片。判定標(biāo)準(zhǔn):每張染色切片均在高倍視野下隨機選取5個視野,計數(shù)200個細(xì)胞;陽性細(xì)胞百分比占比0%、占比<25%、25%～49%、占比≥50%分別計0分、1分、2分、3分,染色強度無著色、淺黃色、黃色、棕黃色分別計0分、1分、2分、3分;兩項評分相乘,評分≥4分為SALL4陽性,評分<4分為SALL4陰性[5]。(2)Western Blot檢測。剪碎適量乳腺癌組織及癌旁組織,加相應(yīng)裂解液。離心后留取上清。用25.0 mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.5 mg/ml。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入96孔板中,不足20 μl的孔加蛋白裂解液補至20 μl。其他孔加2 μl待測樣品并補至20 μl。加BCA工作液200 μl,37℃下孵育0.5 h。用酶標(biāo)儀測562 nm處光密度值,繪制濃度曲線。按體積的1/4加5×loading buffer。凝膠電泳,用PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,脫脂封閉1 h,1×TBST洗膜3次,孵育一抗,搖床30 min,4℃下過夜。用1×TBST洗膜3次,加相應(yīng)二抗,孵育2 h。洗膜,顯色,采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析[6]。(3)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測。SALL4引物序列:上游5′-CCGCACTGAGATGGAAGGT-3′,下游5′-GCTGGGCTGCTAACAAAGG-3′。GAPDH引物序列:上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′,下游5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。提取乳腺癌及癌旁組織的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Oligo(dT)15 1.0 μl、random 1.0 μl加ddH2O至12.5 μl加樣,70℃反應(yīng)5 min,冷卻。離心收集反應(yīng)液,加入dNTP(2.5 mM each)2.0 μl、5×Buffer 4.0 μl、RNasin 0.5 μl、M-MLV 1.0 μl。25℃反應(yīng)10 min、42℃反應(yīng)50 min、80℃反應(yīng)10 min,終止反應(yīng)。實時熒光定量反應(yīng)體系包括SYBR GREEN mastermix 10.0 μl、上游與下游引物序列(10μM)各0.5 μl、cDNA 1.0 μl,ddH2O補足至20.0 μl。反應(yīng)過程包括預(yù)變性(94℃ 5 min)、PCR(94℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s,40個循環(huán))及溶解(72℃ 150 s、40℃ 90 s,60℃～94℃每秒1℃,25℃ 1 min)[7]。

1.2.2 SALL4對阿霉素耐藥性檢測 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞用浴鍋溶解,含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸,離心,棄上清,重懸后接種,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,PBS清洗,加新鮮培養(yǎng)基2.5 ml。細(xì)胞傳代,顯微鏡下計數(shù)。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%,清洗后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。吹打細(xì)胞,收集混合液并離心,去上清后加入1 ml完全培養(yǎng)基。在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4構(gòu)建shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞。將細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后篩選細(xì)胞,傳代并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞以3×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5%CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后用含不同濃度梯度(0、0.5、1.0、10.0 μM)的阿奇霉素處理3種細(xì)胞,MTT法檢測24、48 h后的細(xì)胞增殖活性。檢測時加5 mg/ml的MTT,孵育4 h。棄上清并加200 μl的二甲基亞砜,酶標(biāo)儀測定490 nm處光密度值,計算IC50。

1.2.3 SALL4表達(dá)影響阿霉素耐藥通路分析 采用Western Blot檢測SALL4對MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表達(dá)的影響,以GAPDH作為內(nèi)參,檢測蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中SALL4表達(dá)水平比較 SALL4主要定位于細(xì)胞質(zhì),少量定位于細(xì)胞核,陽性呈棕黃色顆粒。90例患者中,SALL4表達(dá)陽性34例,陽性表達(dá)率為37.78%(34/90)。乳腺癌組織中SALL4蛋白相對表達(dá)水平和SALL4 mRNA相對表達(dá)水平均高于癌旁組織[(1.12±0.17)比(0.93±0.08);(0.063±0.009)比(0.049±0.006)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表達(dá)陽性率比較 不同年齡、病理類型、組織學(xué)分級、腫瘤大小及ER、PR、HER-2、Ki67表達(dá)患者的SALL4表達(dá)陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的SALL4表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表達(dá)陽性率比較/例(百分率/%)

2.3 SALL4對乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性影響 阿霉素處理24、48 h后的MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均高于MCF-7細(xì)胞[(135.17±28.08)μM比(1.46±0.14)μM;(31.94±4.09)μM比(0.17±0.04)μM],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞增殖活性逐漸提高。在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50較MCF-7/ADR細(xì)胞降低[(45.86±5.59)μM比(135.17±28.08)μM;(5.77±0.36)μM比(31.94±4.09)μM],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),即沉默SALL4后MCF-7/ADR細(xì)胞對阿霉素敏感性增強。

2.4 SALL4對PTEN/AKT/mTOR通路影響 MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)低于MCF-7細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)升高,高于MCF-7/ADR細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)下降,低于MCF-7/ADR細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SALL4對PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)影響

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn),SALL4表達(dá)與腫瘤的遷移、侵襲等有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示:90例患者中,SALL4表達(dá)陽性34例,陽性表達(dá)率為37.78%(34/90);不同年齡、病理類型、組織學(xué)分級、腫瘤大小及雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體、Ki67表達(dá)患者的SALL4表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的SALL4表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后的影響因素,考慮與SALL4影響鈣粘素表達(dá)有關(guān)[9-10]。目前,SALL4表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系仍然存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn),SALL4在乳腺癌及癌旁組織中均有表達(dá),且在乳腺癌組織中的表達(dá)高低不等[11-12]。還有研究報道,SALL4在乳腺癌早期就已高表達(dá),且與病理特征無明顯關(guān)系[13]。乳腺癌SALL4表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系有待大樣本量研究進(jìn)行驗證。

有研究發(fā)現(xiàn),SALL4表達(dá)與腫瘤的耐藥性有關(guān),RNA干擾沉默SALL4后可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞侵襲,增加細(xì)胞對替莫唑胺的化學(xué)敏感性[14-15]。也有研究表明,SALL4表達(dá)會影響乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[16-17]。阿霉素是乳腺癌常用的蒽環(huán)類化療藥物,通過擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)并與蛋白酶體結(jié)合轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中解離并釋放,直接作用于癌細(xì)胞DNA,從而阻礙其核酸合成,并干擾DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。單獨用阿霉素或阿霉素聯(lián)合其他抗腫瘤藥是有效控制乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵,但部分患者對阿霉素的反應(yīng)性低或在阿霉素化療一段時間后效果變差[18-19]。積極尋找與耐藥性相關(guān)的分子或基因、揭示乳腺癌的耐藥機制是強化乳腺癌化療效果的重要前提。本研究使用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及其阿霉素耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR,并構(gòu)建了沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞系,在上述3種細(xì)胞系中進(jìn)行阿霉素處理,結(jié)果顯示:阿霉素處理24、48 h后的MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均較MCF-7/ADR細(xì)胞降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,SALL4的表達(dá)會促進(jìn)阿霉素耐藥,沉默SALL4可提高M(jìn)CF-7/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞耐藥性下降,使細(xì)胞增殖受到抑制,即SALL4與MCF-7細(xì)胞的耐藥性相關(guān)[20-21]。

為了驗證SALL4表達(dá)對阿霉素耐藥性的影響是否與PTEN/AKT/mTOR通路有關(guān),本研究采用Western Blot法對MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)低于MCF-7細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)升高,高于MCF-7/ADR細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)下降,低于MCF-7/ADR細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,SALL4表達(dá)會影響PTEN/AKT/mTOR通路基因的表達(dá)。在PTEN/AKT/mTOR通路中,PTEN是起始基因,通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR去磷酸化而影響該信號通路[16]。沉默SALL4會上調(diào)PTEN表達(dá),抑制AKT/mTOR去磷酸化,使p-AKT、p-mTOR表達(dá)下調(diào),抑制該信號通路,從而減弱乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性,增強對阿霉素的敏感性[22-23]。有研究報道,加入去甲基化藥物可上調(diào)PTEN表達(dá),增加成人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性,而使用AKT或mTOR抑制劑也可提高化療藥物的敏感性。上述研究均證實,PTEN/AKT/mTOR通路與化療藥物的耐藥性有關(guān)[24-25]。

綜上所述,SALL4在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。沉默SALL4可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,降低阿霉素的耐藥性,且SALL4對乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響與PTEN/AKT/mTOR通路有關(guān)。