胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測對軍隊(duì)不孕不育夫婦輔助生殖臨床結(jié)局影響研究

鄒朋書, 王喜良, 魏 威, 檀 暢, 于月新, 于佳平

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,遼寧 沈陽 110016

胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetictesting for aneuploidies,PGT-A)是輔助生殖過程中在植入前對胚胎染色體的非整倍體性進(jìn)行的遺傳學(xué)檢測,可指導(dǎo)選擇染色體為整倍體的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植以降低移植失敗或早期自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn),臨床廣泛應(yīng)用于高齡、反復(fù)移植失敗及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者[1-2]。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù),能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定,具有成本低、通量大、速度快、穩(wěn)定性好及結(jié)果精準(zhǔn)等特點(diǎn)[3-4],其通過對胚胎活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞的全基因組測序進(jìn)行胚胎染色體的非整倍體檢測。胚胎染色體非整倍體屬于染色體數(shù)目異常,是自發(fā)性流產(chǎn)、胎兒出生缺陷、發(fā)育異常、嚴(yán)重智力低下的主要原因之一。據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會的PGT-A統(tǒng)計(jì),2016—2017年共活檢4 033枚胚胎,僅有34%的胚胎染色體是整倍體,62%為非整倍體,另有4%為嵌合體[5]。軍隊(duì)官兵是一個(gè)特殊的群體,職業(yè)、環(huán)境、心理及任務(wù)的特殊性使其晚婚晚育現(xiàn)象較為普遍,且婚后兩地分居是常態(tài),因此,延遲生育及不孕不育的問題較為突出,許多官兵夫婦需要通過輔助生殖技術(shù)來解決生育問題[6-7]。本研究旨在探討PGT-A對軍隊(duì)不孕不育夫婦輔助生殖臨床結(jié)局的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自2018年1月至2021年12月收治的接受輔助生殖技術(shù)治療的509對不孕不育官兵夫婦中女性患者的臨床資料。將未行PGT-A且未進(jìn)行鮮胚移植的269例患者納入A組,共285個(gè)單囊胚凍融移植周期。其中,高齡(年齡≥35歲)178例,共192個(gè)凍融移植周期;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(將自然流產(chǎn)≥3次、妊娠周數(shù)<28周且染色體未見異常者歸為復(fù)發(fā)性流產(chǎn))55例,共61個(gè)凍融移植周期。將行PGT-A的240例患者納入B組,共305個(gè)單囊胚凍融移植周期。其中,高齡102例,共127個(gè)凍融移植周期;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)103例,共136個(gè)凍融移植周期;染色體異常78例,共98個(gè)凍融移植周期。除去染色體異常的78例后,將B組中剩余的162例以年齡為依據(jù)進(jìn)行分組,分為年齡<35歲組、35～37歲組及年齡≥38歲組?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng)和囊胚活檢 常規(guī)促排卵后,經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取出卵子。對MⅡ的成熟卵母細(xì)胞通過卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)進(jìn)行體外授精,在卵裂輸卵管液培養(yǎng)液(ART-1026)中培養(yǎng)60～72 h,再轉(zhuǎn)移至囊胚輸卵管液培養(yǎng)液(ART-1029)中培養(yǎng)48～72 h?；顧z篩選4期及以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或外滋養(yǎng)層達(dá)到C級以上的囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。使用激光在待活檢囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)位置打一個(gè)直徑約50 μm的孔,將活檢針對接缺口處吸取6～8個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞,用激光法及機(jī)械法使之脫離囊胚。將活檢的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有磷酸鹽緩沖液的PCR管中,放置冰盒中送檢。

1.2.2 全基因組擴(kuò)增及非整倍體檢測 對活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行全基因組SurePlex擴(kuò)增,使用PGT-A試劑盒(北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器材有限公司)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和文庫構(gòu)建。采用Illumina測序平臺MiSeqDx測序儀進(jìn)行測序,測序數(shù)據(jù)采用《胚胎染色體異倍體分析系統(tǒng)》軟件(北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器材有限公司)對染色體拷貝數(shù)進(jìn)行分析。分析方法為:測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后,比對到人參考基因組上,將整個(gè)參考基因組分為若干窗口并計(jì)算窗口的reads數(shù),然后通過數(shù)據(jù)校正,結(jié)合參考數(shù)據(jù)集確立的參考范圍采用生物信息學(xué)算法進(jìn)行拷貝數(shù)分析,檢測分辨率為4 Mb。

1.3 觀察指標(biāo) 比較B組不同年齡患者的胚胎染色體整倍體率,A組和B組不同年齡患者的臨床結(jié)局,A組和B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床結(jié)局,以及B組各類染色體異常患者的整倍體率、臨床結(jié)局。胚胎檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn):檢測結(jié)果中無整條染色體異常和片段性異常及嵌合情況。非整倍體異常:只要檢測結(jié)果中存在染色體非整倍體(包括嵌合情況)即為染色體整倍性異常。

胚胎染色體整倍體率=胚胎染色體整倍體囊胚數(shù)/檢測成功活檢囊胚數(shù)×100%

臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/凍融移植周期×100%

活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/凍融移植周期×100%

早期流產(chǎn)率=胚胎停育及孕12周以內(nèi)流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 B組不同年齡患者胚胎染色體整倍體率比較 年齡<35歲組60例,平均年齡(31.35±2.24)歲,活檢囊胚數(shù)304枚,整倍體囊胚數(shù)177枚,整倍體率58.22%(177/304)。35～37歲組40例,平均年齡(36.10±0.75)歲,活檢囊胚數(shù)190枚,整倍體囊胚數(shù)98枚,整倍體率51.04%(98/190)。年齡≥38歲組62例,平均年齡(40.18±1.90)歲,活檢囊胚數(shù)289枚,整倍體囊胚數(shù)122枚,整倍體率42.21%(122/289)。年齡<35歲組整倍體率明顯高于年齡≥38歲組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 A組和B組不同年齡患者臨床結(jié)局比較 (1)在年齡<35歲年齡段:A組患者91例,凍融移植周期93個(gè),臨床妊娠率58.06%(54/93),活產(chǎn)率46.24%(43/93),早期流產(chǎn)率18.52%(10/54);B組患者60例,凍融移植周期80個(gè),臨床妊娠率65.00%(52/80),活產(chǎn)率53.75%(43/80),早期流產(chǎn)率13.46%(7/52);兩組臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)在35～37歲年齡段:A組患者63例,凍融移植周期69個(gè),臨床妊娠率50.72%(35/69),活產(chǎn)率40.58%(28/69),早期流產(chǎn)率20.00%(7/35);B組患者40例,凍融移植周期53個(gè),臨床妊娠率60.38%(32/53),活產(chǎn)率49.06%(26/53),早期流產(chǎn)率15.63%(5/32);兩組臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)在年齡≥38歲年齡段:A組患者115例,凍融移植周期123個(gè),臨床妊娠率39.02%(48/123),活產(chǎn)率20.33%(25/123),早期流產(chǎn)率43.75%(21/48);B組患者62例,凍融移植周期74個(gè),臨床妊娠率56.76%(42/74),活產(chǎn)率43.24%(32/74),早期流產(chǎn)率21.43%(9/42);A組臨床妊娠率和活產(chǎn)率低于B組,早期流產(chǎn)率高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 A組和B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者臨床結(jié)局比較 A組55例,平均年齡(35.72±4.51)歲,凍融移植周期61個(gè),臨床妊娠率55.74%(34/61),活產(chǎn)率32.79%(20/61),早期流產(chǎn)率41.18%(14/34)。B組103例,平均年齡(35.58±4.29)歲,凍融移植周期136個(gè),活檢474個(gè),整倍體率52.53%(249/474),臨床妊娠率61.03%(83/136),活產(chǎn)率47.06%(64/136),早期流產(chǎn)率19.28%(16/83)。A組和B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者平均年齡、臨床妊娠率、活產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早期流產(chǎn)率低于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 B組各類染色體異?；颊哒扼w率和臨床結(jié)局比較 78例染色體異常中:相互易位27例,活檢囊胚數(shù)156枚,整倍體囊胚數(shù)39枚,整倍體率25.00%(39/156),凍融移植周期33個(gè),臨床妊娠率69.70%(23/33),活產(chǎn)率63.64%(21/33),早期流產(chǎn)率8.69%(2/23);羅氏易位19例,活檢囊胚數(shù)102枚,整倍體囊胚數(shù)44枚,整倍體率41.51%(44/102),凍融移植周期25個(gè),臨床妊娠率68.00%(17/25),活產(chǎn)率64.00%(16/25),早期流產(chǎn)率5.88%(1/17);倒位12例,活檢囊胚數(shù)38枚,整倍體囊胚數(shù)22枚,整倍體率57.89%(22/38),凍融移植周期16個(gè),臨床妊娠率75.00%(12/16),活產(chǎn)率75.00%(12/16),早期流產(chǎn)率0(0);染色體非整倍體5例,活檢囊胚數(shù)22枚,整倍體囊胚數(shù)12枚,整倍體率54.55%(12/22),凍融移植周期7個(gè),臨床妊娠率28.57%(2/7),活產(chǎn)率28.57%(2/7),早期流產(chǎn)率0(0);Y染色體微缺失15例,活檢囊胚數(shù)46枚,整倍體囊胚數(shù)18枚,整倍體率39.13%(18/46),凍融移植周期17個(gè),臨床妊娠率76.47%(13/17),活產(chǎn)率70.59%(12/17),早期流產(chǎn)率7.69%(1/13)。各類染色體異常整倍體率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各類染色體異常臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

胚胎的非整倍性是體外受精失敗的主要原因,在世界范圍內(nèi),已有多個(gè)生殖中心通過對胚胎活檢并運(yùn)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行PGT-A[8]。胚胎的非整倍體與女性年齡高度相關(guān),隨著女性年齡的增加,卵子減數(shù)分裂過程中發(fā)生錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)升高,卵母細(xì)胞發(fā)育長期停滯,受精后有絲分裂異常,導(dǎo)致胚胎染色體嵌合[9]。軍隊(duì)官兵晚婚晚育現(xiàn)象普遍,婚后兩地分居導(dǎo)致了延遲生育,女方生育年齡普遍偏高。本研究結(jié)果顯示,年齡<35歲組整倍體率明顯高于年齡≥38歲組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,女方年齡越大,胚胎染色體整倍體率越低。本研究結(jié)果還顯示,在年齡≥38歲年齡段,A組臨床妊娠率39.02%(48/123)、活產(chǎn)率20.33%(25/123)、早期流產(chǎn)率43.75%(21/48),B組臨床妊娠率56.76%(42/74)、活產(chǎn)率43.24%(32/74)、早期流產(chǎn)率21.43%(9/42),A組臨床妊娠率和活產(chǎn)率低于B組,早期流產(chǎn)率高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,年齡≥38歲的女性患者更應(yīng)該選擇PGT-A以進(jìn)行胚胎篩選,這能幫助不孕不育夫婦獲得更好的臨床結(jié)局,與既往研究[10]結(jié)論一致。高齡患者行PGT-A面臨的極大困難是,較多高齡女性的卵母細(xì)胞募集數(shù)量少且質(zhì)量差,胚胎很難培養(yǎng)直至囊胚期行活檢。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者利用PGT-A技術(shù)對胚胎染色體進(jìn)行整倍體篩選,對拷貝數(shù)正常的胚胎進(jìn)行移植,可有效阻斷染色體異常胚胎植入,能夠增加復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的胚胎著床率,提高臨床妊娠率,降低自然流產(chǎn)發(fā)生率[11-12],有效避免因胚胎染色體非整倍體導(dǎo)致的種植失敗,以及因胚胎染色體異常所導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。本研究中,A組和B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者臨床妊娠率、活產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),B組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早期流產(chǎn)率低于A組(P<0.05)。隨著軍隊(duì)不孕不育患者對輔助生殖臨床妊娠率、活產(chǎn)率等要求的逐漸提高,越來越多復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者選擇采取PGT-A助孕,減少因反復(fù)流產(chǎn)帶來的傷害。

染色體相互易位、羅氏易位、Y染色體微缺失等易導(dǎo)致胚胎非整倍體發(fā)生。在生殖細(xì)胞減速分裂過程中,相互易位染色體在減數(shù)分裂配對時(shí)形成4射體,將產(chǎn)生18種配子,其中,1/18是攜帶者,1/18是完全正常,16/18是異常。羅氏易位染色體在減數(shù)分裂配對過程中形成3射體,染色體分離時(shí)產(chǎn)生6種配子,1/6是攜帶者,1/6是完全正常,4/6是異常。倒位配子在減數(shù)分裂時(shí)形成倒位環(huán),分離后形成4種配子,1/4是正常,1/4是攜帶者,2/4為部分重復(fù)和缺失的無著絲粒或雙著絲粒的不平衡配子。本研究中,染色體相互易位、羅氏易位、倒位患者的整倍體率分別為25.00%(39/156)、41.51%(44/102)、57.89%(22/38),正常胚胎概率均高于理論值[13]。這可能是由于活檢篩選4期及以上的囊胚且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或外滋養(yǎng)層達(dá)到C級以上,胚胎在體外培養(yǎng)過程中,有些胚胎因?yàn)槿旧w的非整倍體停滯發(fā)育,無法順利形成囊胚[14-15]。染色體非整倍體5例患者分別為:2例47,XXX;1例45,X[45]/47,XXX[55];1例47,XXX[13]/46,XX[51];1例47,XYY。上述患者均涉及性染色體的非整倍體或性染色體非整倍體嵌合,患者性染色體異常通常會造成卵巢子宮發(fā)育情況欠佳[16],導(dǎo)致臨床妊娠率和活產(chǎn)率較低。染色體相互易位、羅氏易位、倒位、Y染色體微缺失患者行PGT-A將整倍體胚胎移植后,臨床妊娠率達(dá)到70%左右、活產(chǎn)率達(dá)到60%～75%,臨床效果顯著。對于染色體異常的軍隊(duì)不孕不育夫婦,PGT-A可大大提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率,降低早期流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn),改善臨床妊娠結(jié)局。

綜上所述,對于軍隊(duì)不孕不育夫婦,PGT-A可有效改善高齡患者妊娠結(jié)局,避免因染色體非整倍體性增加而導(dǎo)致的自然流產(chǎn),降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的早期流產(chǎn)率,提高活產(chǎn)率。