基于P 物質(zhì)的二冬二母二草湯止咳作用及機制研究

李惠惠 袁維蔚 陳奕濤 陳洪

二冬二母二草湯是廣東省名中醫(yī)陳洪教授根據(jù)自身臨床經(jīng)驗, 結(jié)合名醫(yī)施金墨“對藥”思想所創(chuàng), 由麥冬、天冬、浙貝母、知母、甘草、魚腥草組成, 具有清金潤肺、甘涼養(yǎng)陰的功效, 主治肺陰虧虛型咳嗽, 癥見干咳、痰中帶血絲、痰少黏白、咳聲短促, 或有盜汗、顴紅、午后潮熱、聲音嘶啞、口干咽燥, 臨床上多用于感染后咳嗽、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等疾病見上述癥狀者。本課題組于前期研究中發(fā)現(xiàn)二冬二母二草湯具有良好的止咳效果［1,2］, P 物質(zhì)(substance P, SP)在咳嗽反射中的作用已經(jīng)非常明確［3］, 據(jù)此, 本研究擬基于SP 對二冬二母二草湯的止咳作用及機制進行探討, 以期為該方的臨床應(yīng)用提供一定的實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 本研究所有的動物實驗操作均參照惠州市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物委員會規(guī)定的相關(guān)文件進行, 已獲得惠州市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。KM小鼠,體重20±2 g, 雌雄各半；英國種豚鼠, 體重250±50 g,雌雄兼用。實驗動物均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供, 實驗單位生產(chǎn)許可證編號：SCXK(粵)2018-0002,實驗單位使用許可證編號：SYXK(粵)2018-0002。

1.2 藥物 二冬二母二草湯(麥冬15 g、天冬15 g、浙貝母15 g、知母20 g、甘草6 g、魚腥草15 g), 由惠州市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。磷酸可待因由國藥集團工業(yè)股份有限公司提供, 批號20190601, 規(guī)格：30 mg/片。

1.3 試劑 氨水(廣州上品化工有限公司)；枸櫞酸(上海杭涌環(huán)?？萍加邢薰?；辣椒素(Sigma)；豚鼠SP試劑盒(美國R＆D 公司)。

1.4 儀器 VARIOS-KAN 酶標儀(廣州吉源生物科技有限公司)。980-A 型超聲霧化器(上海沫錦醫(yī)療器械有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 二冬二母二草湯對氨水引咳小鼠咳嗽的影響取50 只KM 小鼠, 隨機分為五組, 分別為空白對照組(蒸餾水)、磷酸可待因組(10 ml/kg)、二冬二母二草湯高劑量組(14.2 g 生藥/kg)、二冬二母二草湯正常劑量組(7.1 g 生藥/kg)、二冬二母二草湯低劑量組(3.55 g生藥/kg)。采用灌胃方式對各組小鼠進行給藥, 給藥1 次/d、連續(xù)3 d, 容積為10 ml/kg。末次給藥30 min后, 在100 mg 滅菌棉球中注入使用1 ml 注射器抽取的0.5 ml 氨水, 在倒置的1 L 玻璃燒杯內(nèi)將棉球與小鼠一起置入, 以小鼠張嘴、腹肌劇烈收縮為咳嗽界定標準,記錄小鼠咳嗽潛伏期及2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5.2 二冬二母二草湯對枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽的影響實驗前1 d 在4 L 密閉玻璃鐘罩內(nèi)將豚鼠置入, 預(yù)先配置好17.5%枸櫞酸, 使用980-A 型超聲霧化器以最大噴霧量噴入10 s, 以聽到咳嗽聲為界定標準, 記錄豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù), 篩選咳嗽次數(shù)大于10 次者為合格豚鼠用于實驗。取35 只合格豚鼠隨機分為五組, 分別為空白對照組(蒸餾水)、磷酸可待因組(10 ml/kg)、二冬二母二草湯高劑量組(14.2 g 生藥/kg)、二冬二母二草湯正常劑量組(7.1 g 生藥/kg)、二冬二母二草湯低劑量組(3.55 g 生藥/kg)。采用灌胃方式對各組豚鼠進行給藥, 給藥1 次/d、連續(xù)5 d, 容積為10 ml/kg。末次給藥30 min 后, 在4 L 密閉玻璃鐘罩內(nèi)將豚鼠置入, 預(yù)先配置好17.5%枸櫞酸, 使用980-A 型超聲霧化器以最大噴霧量噴入10 s, 記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5.3 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠咳嗽次數(shù)的影響 實驗前1 d 在4 L 密閉玻璃鐘罩內(nèi)將豚鼠置入,預(yù)先配置好30 μmol 辣椒素, 使用980-A 型超聲霧化器以0.7 ml/min 噴霧量持續(xù)噴霧40 s, 豚鼠的咳嗽聲響亮,以聽到咳嗽聲為界定標準, 記錄豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù), 篩選咳嗽次數(shù)>10 次者為合格豚鼠用于實驗。取40 只合格豚鼠隨機分為五組, 分別為空白對照組(蒸餾水)、磷酸可待因組(10 ml/kg)、二冬二母二草湯高劑量組(14.2 g 生藥/kg)、二冬二母二草湯正常劑量組(7.1 g生藥/kg)、二冬二母二草湯低劑量組(3.55 g 生藥/kg)。采用灌胃方式對各組豚鼠進行給藥, 給藥1 次/d、連續(xù)5 d, 容積為10 ml/kg。末次給藥30 min 后, 在4 L 密閉玻璃鐘罩內(nèi)將豚鼠置入, 預(yù)先配置好30 μmol辣椒素,使用980-A 型超聲霧化器以0.7 ml/min 噴霧量持續(xù)噴霧40 s, 記錄豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5.4 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠血清SP 含量的影響 完成1.5.3 實驗后, 增設(shè)6 只同批次模型對照組(蒸餾水), 再隨機抽取1.5.3 實驗中各組的豚鼠6 只, 取股動脈血, 在室溫狀態(tài)將血液自然凝固10～20 min 后離心(20 min, 轉(zhuǎn)速2500 r/min)。使用酶標儀以450 nm 波長, 按試劑盒說明書操作步驟, 測定離心后上清液的分光光度值, 并根據(jù)標準曲線計算豚鼠血清SP 含量。

1.5.5 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠支氣管肺泡灌洗液中SP 含量的影響 完成1.5.4 實驗后, 立即使用12 號鈍針頭抽取4 ml 冰蒸餾水進行支氣管肺泡灌洗, 反復(fù)灌洗3 次, 收集灌洗液后離心(20 min,轉(zhuǎn)速2500 r/min)。使用酶標儀以450 nm 波長, 按試劑盒說明書操作步驟, 測定離心后上清液的分光光度值, 并根據(jù)標準曲線計算豚鼠支氣管肺泡灌洗液中SP含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗；符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二冬二母二草湯對氨水引咳小鼠咳嗽潛伏期、2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響 磷酸可待因組、二冬二母二草湯高劑量組、二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組氨水引咳小鼠的咳嗽潛伏期均長于空白對照組, 2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)均少于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。見表1。

表1 二冬二母二草湯對氨水引咳小鼠咳嗽潛伏期、2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s)

表1 二冬二母二草湯對氨水引咳小鼠咳嗽潛伏期、2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s)

注：與空白對照組比較, aP<0.01

組別 鼠數(shù)(只) 劑量 咳嗽潛伏期(s) 2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)(次)空白對照組組 10 18.94±5.77 48.52±8.96磷酸可待因組 10 10 ml/kg 59.97±13.38a 13.75±5.94a二冬二母二草湯高劑量組 10 14.2 g 生藥/kg 40.42±16.32a 20.31±5.01a二冬二母二草湯正常劑量組 10 7.1 g 生藥/kg 74.53±18.03a 14.03±4.07a二冬二母二草湯低劑量組 10 3.55 g 生藥/kg 52.04±24.95a 21.02±9.99a

2.2 二冬二母二草湯對枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽潛伏期、5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響 二冬二母二草湯高劑量組、二冬二母二草湯低劑量組枸櫞酸引咳豚鼠的咳嗽潛伏期均長于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)；磷酸可待因組、二冬二母二草湯正常劑量組枸櫞酸引咳豚鼠的咳嗽潛伏期與空白對照組比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。磷酸可待因組、二冬二母二草湯高劑量組、二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組枸櫞酸引咳豚鼠的5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)均少于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05 或<0.01)。見表2。

表2 二冬二母二草湯對枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽潛伏期、5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s)

表2 二冬二母二草湯對枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽潛伏期、5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s)

注：與空白對照組比較, aP<0.05, bP<0.01

組別 鼠數(shù)(只) 劑量 咳嗽潛伏期(s) 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)(次)空白對照組 7 15.97±5.84 29.89±5.04磷酸可待因組 7 10 ml/kg 25.83±11.72 16.08±11.15a二冬二母二草湯高劑量組 7 14.2 g 生藥/kg 77.41±22.05b 18.27±10.82a二冬二母二草湯正常劑量組 7 7.1 g 生藥/kg 23.06±8.53 8.00±5.17b二冬二母二草湯低劑量組 7 3.55 g 生藥/kg 62.63±15.63b 17.08±10.99a

2.3 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響 磷酸可待因組、二冬二母二草湯高劑量組、二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組辣椒素引咳豚鼠的5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)均少于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。見表3。

表3 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s, 次)

表3 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響( ±s, 次)

注：與空白對照組比較, aP<0.01

組別 鼠數(shù)(只) 劑量 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)空白對照組 8 21.94±4.89磷酸可待因組 8 10 ml/kg 9.13±3.07a二冬二母二草湯高劑量組 8 14.2 g 生藥/kg 14.88±3.94a二冬二母二草湯正常劑量組 8 7.1 g 生藥/kg 8.14±2.96a二冬二母二草湯低劑量組 8 3.55 g 生藥/kg 12.13±3.95a

2.4 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠血清/支氣管肺泡灌洗液中SP 含量的影響 空白對照組辣椒素引咳豚鼠血清及支氣管肺泡灌洗液中SP 含量高于模型對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05) ；磷酸可待因組、二冬二母二草湯高劑量組、二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組辣椒素引咳豚鼠血清SP含量低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05 或<0.01)；二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組辣椒素引咳豚鼠支氣管肺泡灌洗液中SP 含量低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)；磷酸可待因組、二冬二母二草湯高劑量組辣椒素引咳豚鼠支氣管肺泡灌洗液中SP 含量與空白對照組比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠血清/支氣管肺泡灌洗液中SP 含量的影響( ±s, ng/L)

表4 二冬二母二草湯對辣椒素引咳豚鼠血清/支氣管肺泡灌洗液中SP 含量的影響( ±s, ng/L)

注：與空白對照組比較, aP<0.05, bP<0.01

組別 鼠數(shù)(只) 劑量 血清SP 含量 支氣管肺泡灌洗液中SP 含量模型對照組 6 106.87±15.76a 121.76±14.99a空白對照組 6 129.85±16.90 147.48±20.05磷酸可待因組 6 10 ml/kg 106.93±14.17a 131.63±27.13二冬二母二草湯高劑量組 6 14.2 g 生藥/kg 103.94±10.01b 129.85±9.90二冬二母二草湯正常劑量組 6 7.1 g 生藥/kg 102.83±14.12a 119.97±11.88a二冬二母二草湯低劑量組 6 3.55 g 生藥/kg 108.68±15.04a 119.97±15.05a

3 討論

Von Euler 和Gaddum 等于1931 年在馬的腸和腦提取物中尋找乙酰膽堿同時發(fā)現(xiàn)了SP, 它的化學(xué)和生物學(xué)特性均較為特殊［4］。SP 是一種神經(jīng)肽, 屬于速激肽家族［5,6］。SP 的合成主要在脊髓背根神經(jīng)節(jié), 于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布, 且多存在于無髓鞘的C 類纖維內(nèi), 向下移行至感覺神經(jīng)的神經(jīng)末梢, 向上移行至脊髓后角［7-10］。SP 由神經(jīng)元胞體合成轉(zhuǎn)運, 在感覺神經(jīng)(C 類纖維)末梢中, 當受到枸櫞酸、辣椒素、感染、吸煙、干燥寒冷氣體、高滲鹽水、變應(yīng)原、緩激肽、組胺、臭氧等各種理化刺激時, 可反過來再刺激C 類纖維, 逆向釋放進入局部組織中。SP 的釋放可引起氣管和支氣管分泌功能亢進, 血管通透性增加, 咳反射閾值下降, 支氣管收縮等, 從而導(dǎo)致咳嗽的產(chǎn)生［11-13］。

本研究結(jié)果顯示：二冬二母二草湯高劑量組(14.2 g 生藥/kg)、正常劑量組(7.1 g 生藥/kg)、低劑量組(3.55 g 生藥/kg)對氨水引咳小鼠、枸櫞酸引咳豚鼠、辣椒素引咳豚鼠三種咳嗽模型均有不同程度的止咳作用；二冬二母二草湯高劑量組、正常劑量組、低劑量組均能顯著降低辣椒素引咳豚鼠血清SP 含量, 二冬二母二草湯正常劑量組、二冬二母二草湯低劑量組均能顯著降低辣椒素引咳豚鼠支氣管肺泡灌洗液中SP 含量, 提示該方的止咳作用機制可能與抑制SP 含量有關(guān)。