交通任督針刺法對血管性癡呆大鼠CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及學(xué)習(xí)記憶功能的影響

李新華,郭 霞,趙立新

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由各種復(fù)雜的腦血管因素引起的腦組織損害而造成以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的一種癡呆綜合征[1],是老年人群的常見病、多發(fā)病,是僅次于阿爾茨海默病的癡呆[2]。血管性癡呆作為目前唯一一種可以預(yù)防的癡呆類型,如果及早發(fā)現(xiàn)、早期診斷明確、及時干預(yù)治療,血管性癡呆是可以防治的,是可逆的[3],但到目前為止,仍沒有統(tǒng)一和有效的治療方法[4]。因此,對于血管性癡呆防治的臨床研究及實驗研究具有相當(dāng)重要的現(xiàn)實意義?！敖煌ㄈ味健贬槾谭ㄊ巧轿魇≈嗅t(yī)院原針灸科主任郭耀康教授在長期針灸臨床實踐中創(chuàng)立的針灸理論和療法,并將其應(yīng)用于治療血管性癡呆,療效顯著。隨著對血管性癡呆發(fā)病機制的不斷深入研究,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用越來越受到重視。本研究采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(改良2-VO)法復(fù)制全腦缺血模型,以“交通任督法”取風(fēng)府、百會、人中、關(guān)元、中脘穴位進(jìn)行針刺干預(yù),觀察其對血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能、海馬CA1區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的影響,探討交通任督針刺法干預(yù)血管性癡呆大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠60只,雄性,月齡2～3個月,體質(zhì)量(210±10)g。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0004。按照隨機數(shù)字表分為空白組(12只)、假手術(shù)組(12只)和手術(shù)組(36只)。

1.2 實驗藥品及試劑

尼莫地平片(商品名:尼膜同,拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)),注射用青霉素鈉[中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司],BDNF抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),BDNF二抗(BiOS公司),聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Solarbio公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(SEVEN公司),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速凝膠配置試劑盒(SEVEN公司),彩虹130廣譜蛋白Marker(Solarbio公司),β-actin內(nèi)參引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],超敏增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)檢測試劑盒(賽文生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗材料及儀器

漢醫(yī)牌一次性使用無菌針灸針(長春愛康醫(yī)藥器械有限公司,規(guī)格為0.25 mm×13 mm);Morris水迷宮(型號:DMS-2,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);全自動全封閉脫水機(型號:Excelsior,美國Thermo公司);石蠟包埋機(型號:TKY-BMB,湖北康泰醫(yī)療設(shè)備有限公司);包埋專用冷臺(型號:TKY-BMB,湖北秦康醫(yī)療設(shè)備有限公司);旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(型號:F325,德國Thermo公司);攤片機(型號:TKY-TPA,湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司);烤片機(型號:TKY-TPA,湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司);萬能熒光成像系統(tǒng)(型號:BX51-DP72,日本奧林巴斯);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號:101-2-S,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);低溫臺式離心機(型號:Auegrax-30K,美國 Beckman Coulter公司);脫色水平搖床(型號:TS-1000,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);雙向電泳系統(tǒng)(PROTEANi12 IEF Mini-PROTEAN Tetra PROTEAN 11 XL,美國Bio-Rad公司);半干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(TRans-Blot SemiDry PowerPac Universal,美國Bio-Rad公司);高性能成像分析儀(型號:HD2,美國ProteinSimple公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備

隨機選取空白對照組、假手術(shù)組各12只,手術(shù)組36只大鼠采用改良2-VO法制備全腦缺血模型,在不同時點永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈[5-7],即采用每間隔3 d分2次永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈法制備模型。將大鼠用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后,仰臥位固定在手術(shù)臺上,常規(guī)消毒,頸正中切口,先分離一側(cè)頸總動脈,用1號縫合線結(jié)扎兩端,中間永久性剪斷,縫合傷口,后肢肌內(nèi)注射青霉素鈉4×104U,放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上,但不阻斷頸總動脈,間隔3 d后結(jié)扎、剪斷另一側(cè)頸總動脈。術(shù)后7 d切口愈合,進(jìn)行Morris水迷宮測試,與造模前比較有明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙為成功制備血管性癡呆大鼠模型。癡呆標(biāo)準(zhǔn)以對照組大鼠逃避時間的均值為參考值,計算實驗組大鼠各時段成績的平均逃避潛伏期與參考值之差占該大鼠平均逃避潛伏期時間的比例,>20%確定為癡呆大鼠。

1.4.2 動物分組及給藥

將造模后大鼠隨機分為模型組、交通任督法針刺組(針刺組)、尼莫地平組。針刺組:取一次性使用無菌針灸針(規(guī)格0.25 mm×13 mm),參照林文注等編著的《實驗針灸學(xué)》選穴:風(fēng)府(天門)、百會、人中、關(guān)元、中脘,取穴及針刺法見表1,深度約0.5寸,平補平瀉,留針30 min,每日1次,連續(xù)15 d。尼莫地平組:給予尼莫地平片12 mg/kg,按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥,每日1次,連續(xù)15 d?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組不做任何治療。

表1 取穴及針刺法

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行和空間搜索能力比較(±s)

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮行為學(xué)測試

在造模前、造模后、治療后分別進(jìn)行水迷宮實驗檢測。定位航行實驗(place navigation):歷時5 d。正式實驗時將平臺固定在1個象限,位于水面下1.5 cm,水溫穩(wěn)定在(25.0±0.5)℃,實驗室中物品和人員的位置在實驗期間固定不變,作為動物的空間參照物。每天測試2次,每次從不同的入水點將動物面向池壁放入水中,檢測時間為60 s,在平臺上停留超過2 s則判定為尋臺成功,將動物從入水到尋臺成功所需的時間記作逃避潛伏期,若60 s內(nèi)未找到平臺則潛伏期記為60 s。每次測試前先將動物置于平臺上停留15 s,稱為適應(yīng),測試完畢不論尋臺是否成功均適應(yīng)10 s。計算每天潛伏期平均值,以評價動物空間記憶的獲得能力?？臻g搜索實驗(spatial probe):定位航行實驗結(jié)束次日,拆除平臺,選擇某一象限作為入水象限,通過動物在60 s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)、原平臺象限游程比率及時間比率來評價動物的空間記憶能力。

1.5.2 海馬CA1區(qū)蘇木精-伊紅(HE)染色組織形態(tài)學(xué)觀察

1)灌注取腦:各組大鼠于行為學(xué)檢測結(jié)束后,腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉,打開胸腔,充分暴露心臟,自心尖插入灌注針頭直至主動脈,剪開右心耳,開放靜脈血。灌注生理鹽水約200 mL至流出液澄清,換用4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注約300 mL進(jìn)行前固定,至大鼠全身僵硬,肝臟發(fā)白為止。剪開皮膚暴露頭及頸段,從頸椎處剪斷頸髓,分離除去后頸部肌肉后用彎鉗仔細(xì)剔除顱骨,從延髓開始,慢慢分離顱底組織,完整取出大腦放入4%多聚甲醛中后固定備用。2)石蠟包埋與切片。3)HE染色觀察:常規(guī)脫蠟、HE染色、脫水、透明、封片。4)光鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測

采用Western Blot檢測各組BDNF表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 成模率

手術(shù)組36只大鼠采用改良2-VO法造模后,3只死亡,3只不成模,有30只成模,成模率83.3%。

2.2 交通任督法對血管性癡呆模型大鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

模型組定位航行潛伏期較空白組及假手術(shù)組明顯延長(P<0.05),空間搜索穿越次數(shù)明顯少于空白組和假手術(shù)組(P<0.05),說明模型組學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降;針刺組、尼莫地平組定位航行潛伏期均明顯短于模型組(P<0.05),空間搜索穿越次數(shù)均較模型組增加(P<0.05),針刺組、尼莫地平組定位航行潛伏期和空間搜索穿越次數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明針刺和尼莫地平均可明顯改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,兩者作用相近。詳見表1。

2.3 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,胞漿豐富,細(xì)胞核呈圓形、橢圓形,染色質(zhì)在核內(nèi)分布較均勻,核仁清晰,間質(zhì)無水腫表現(xiàn);模型組細(xì)胞排列紊亂,大量神經(jīng)元變性,體積變小,胞核與胞漿界限不清,核固縮成三角形或不規(guī)則形,核仁消失,血管、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙擴大;尼莫地平組、針刺組神經(jīng)元細(xì)胞零星可見一些損傷細(xì)胞,海馬錐體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列基本正常。表明針刺組和尼莫地平組均能保護(hù)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞,減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷。詳見圖1。

圖1 各組海馬組織CA1區(qū)組織細(xì)胞HE染色(×400)

2.4 各組BDNF蛋白表達(dá)比較

與模型組相比,假手術(shù)組、針刺組和尼莫地平組BDNF蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01);與假手術(shù)組相比,針刺組與尼莫地平組BDNF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);針刺組和尼莫地平組BDNF蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 各組BDNF蛋白表達(dá)條帶圖

圖3 各組BDNF蛋白表達(dá)比較

3 討 論

郭耀康教授在長期臨床工作中創(chuàng)立了“交通任督法”的學(xué)術(shù)思想,是以任督二脈的風(fēng)府、百會、人中、中脘、關(guān)元等穴位為主穴,施以一定的針刺手法,使陰陽臟腑、經(jīng)絡(luò)氣血平衡而治愈疾病。郭耀康教授從事針灸臨床工作50余年,認(rèn)為人體疾病發(fā)生的根本為陰陽失調(diào),正如《素問· 陰陽應(yīng)象大論》曰:“陰陽者,天地之道也,萬物之綱紀(jì),變化之父母,生殺之本始,神明之府也”。而任督二脈為人體陰陽的總匯,兩者一源而二歧,督脈則由會陰而行背,任脈則由會陰而行腹,最后交接于口周。督脈總督一身之陽,任脈總督一身之陰,任督二脈共同構(gòu)成一個陰陽循環(huán)的體系,故任督二脈經(jīng)氣循環(huán)通暢,對于五臟六腑、十二經(jīng)脈都起著重要作用[8]。

血管性癡呆屬于中醫(yī)“癡呆”的范疇,病位在腦,病機為髓海不足,氣、火、痰、瘀內(nèi)阻于腦。癡呆的發(fā)生與任督二脈密切相關(guān),從循行分布上看,《難經(jīng)·二十八難》記載:“督脈者……起于下極之腧,并于脊里,上至風(fēng)府,入屬于腦”“任脈者,起于中極之下,以上至毛際,循腹里……入目絡(luò)舌”;又如《素問·骨空論》記載督脈的分支“上額交巔上,入絡(luò)腦”“督脈、任脈和諸陽皆起于頭”。從功能角度上看,腦位于顱內(nèi),為髓之海,其功能的發(fā)揮有賴于任脈的氣血津液濡養(yǎng);督脈則通髓達(dá)腦。因此,任督二脈對治療腦部疾病有非常重要的意義,運用任督二脈的腧穴,可有效調(diào)整人體陰陽的平衡[9]。

交通任督法針刺處方中風(fēng)府、百會、人中為督脈要穴,百會為諸陽經(jīng)之會,內(nèi)絡(luò)于腦,風(fēng)府為督脈入腦之處?！秲?nèi)經(jīng)》云:“腦為髓海,其輸在于蓋(即百會),下在風(fēng)府”,此二穴與腦髓密切相關(guān),可疏通經(jīng)絡(luò)氣血、調(diào)神益智、添精益髓。人中為督脈、手足陽明之會穴,對針刺感應(yīng)強烈,具有疏通經(jīng)絡(luò)、醒神開竅的功效,可調(diào)節(jié)腦內(nèi)氣血的盛衰。有研究發(fā)現(xiàn),百會尤擅改善血管性癡呆病人的記憶能力、計算能力,人中尤擅改善血管性癡呆病人的反應(yīng)、嗜臥、恍惚等癥狀[10]。關(guān)元、中脘為任脈要穴。關(guān)元為先天之氣海,為五臟六腑之本,有補腎益氣、活血通絡(luò)、培元固本之效;中脘是胃經(jīng)之募穴,脾胃為后天之本,氣血生化之源,能健脾和胃、扶正固本?！毒霸廊珪て⑽刚摗?“水谷之海,本賴先天為之主;而精血之海,又賴后天為之資”。關(guān)元、中脘同用,先天與后天相互資生,可補益氣血津精、補腦充髓。諸穴共用,可疏通任督二脈經(jīng)氣、調(diào)和氣血陰陽臟腑、調(diào)神益智,使氣血精津充盛,髓海得以濡養(yǎng),從而有效改善血管性癡呆的癥狀。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),血管性癡呆的發(fā)生常與海馬的缺血改變密切相關(guān),而海馬是缺血損傷的敏感區(qū)域[11],直接參與信息儲存和回憶,主要功能與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。在海馬結(jié)構(gòu)中,CA1區(qū)是與人類學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系最為密切的功能亞區(qū),短暫、嚴(yán)重的全腦缺血引起的神經(jīng)元遲發(fā)性死亡,多發(fā)生在海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞中,該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的丟失可能導(dǎo)致嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。

隨著科研人員對血管性癡呆發(fā)病機制的不斷深入,神經(jīng)營養(yǎng)因子在血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用越來越受到重視。BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要代表,主要由海馬和大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元產(chǎn)生,對神經(jīng)元的分化、生長和生存起重要作用,可修復(fù)損傷的神經(jīng)元[13-14],能調(diào)節(jié)突觸可塑性,參與學(xué)習(xí)記憶過程,并可改善受損的學(xué)習(xí)、記憶能力[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn),短暫性或持續(xù)性腦組織缺血均可刺激內(nèi)源性BDNF表達(dá)上升,具有內(nèi)源性自我保護(hù)作用,促進(jìn)受損神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù),加速受損神經(jīng)元細(xì)胞的分化及再生過程,并抑制細(xì)胞死亡[17]。還有研究發(fā)現(xiàn),腦缺血缺氧后的動物反應(yīng)和記憶均較差,腦組織中BDNF水平也明顯降低,腦內(nèi)注射BDNF可以在一定程度上改善動物的學(xué)習(xí)和記憶能力[18-19]。BDNF通過多種途徑保護(hù)缺血缺氧細(xì)胞,實現(xiàn)其對缺損神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,針刺組定位航行潛伏期明顯延長(P<0.05),空間搜索穿越次數(shù)明顯增多(P<0.05);海馬形態(tài)學(xué)方面,針刺組神經(jīng)元細(xì)胞均可見零星損傷細(xì)胞,海馬錐體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列基本正常,較模型組有明顯改善;針刺組BDNF表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),針刺組和尼莫地平組定位航行潛伏期、空間搜索穿越次數(shù)、海馬形態(tài)學(xué)、BDNF表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。交通任督針刺法對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的改善作用,其機制可能是通過針刺提高海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。