基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)解析蘇木配方顆粒的化學(xué)物質(zhì)組成及裂解規(guī)律

顏繼忠,吳亞夢,曾結(jié)林,白 芮,張 慧

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

蘇木為豆科植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材[1],原產(chǎn)于東南亞和南印度,常用作天然紅色染料、食用色素,以及作為中藥用于鎮(zhèn)痛消炎和促進血液循環(huán)。研究證實這種藥用植物還具有促進血管舒張、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗菌和抗炎等作用[1]。蘇木化學(xué)成分復(fù)雜,其含有大量的黃酮類成分[2],主要包括黃酮類(Flavones)、黃酮醇類(Flavonol)、二氫黃酮類(Dihydroflavone)、二氫黃酮醇類(Dihydroflavonol)、異黃酮類(Isoflavone)、查爾酮類(Chalcones)、黃烷酮類(Flavanes)、花色素類(Anthocyanidins)和高異黃酮類(Homoisoflavonoids)等[2],以及其他藥理活性成分,如原蘇木素類(Protosappanins)。

蘇木配方顆粒是由蘇木飲片經(jīng)過提取、濃縮、干燥和制粒等工序,供醫(yī)生臨床配方使用的單味中藥濃縮顆粒。目前,關(guān)于蘇木的文獻報道主要集中在醇提物的化學(xué)成分以及藥理作用研究,對蘇木水提液中的化學(xué)成分研究較少,且尚未見蘇木配方顆粒的化學(xué)組成文獻報道。筆者利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對蘇木配方顆粒進行化學(xué)成分分析和裂解規(guī)律研究,歸納了查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類化合物在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律,為后續(xù)蘇木配方顆粒的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國Agilent科技有限公司);ACQUITY UPLC(美國Waters公司)-Triple TOFTM 5600+型高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex公司);電子天平(YP502N,上海菁海儀器有限公司),萬分之一電子天平(BS124,賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R210+V700,瑞士Buchi公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE,鞏義市予華儀器有限公司)。

1.2 材 料

色譜級甲醇(TEDIA);色譜級乙腈(TEDIA);娃哈哈純凈水;(±)原蘇木素B(購于成都普思生物科技股份有限公司,批號:PS0359-0020);巴西蘇木素對照品(購于成都普思生物科技股份有限公司,批號:PS0358-0025);蘇木配方顆粒(批次:19507)由浙江貝尼菲特藥業(yè)有限公司提供。

2 方 法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。以乙腈為流動相A,以純水為流動相B,梯度洗脫:0～<15 min,15% A;15～<30 min,15%～30% A;30～40 min,30%～100% A;流速1.0 mL/min;檢測波長285 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀。在ESI正、負(fù)離子模式下對供試品溶液進行檢測。一級質(zhì)譜掃描范圍m/z為100～1 500,二級質(zhì)譜掃描范圍m/z為50～1 500;負(fù)離子模式,霧化氣(GSI)為50 Psi;氣簾氣(CUR)為35 Psi;離子源溫度(TEM)為550 ℃;離子源電壓(IS)為-4 500 V;一級掃描去簇電壓為80 V;碰撞能量為5 V。正離子模式,霧化氣(GSI)為50 Psi;氣簾氣(CUR)為35 Psi;離子源溫度(TEM)為600 ℃;離子源電壓(RS)為+5 500 V;一級掃描去簇電壓為80 V;碰撞能量為5 V。

2.2 溶液的配制

取蘇木配方顆粒適量,研細(xì),取0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL后稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)20 min,放冷,再次稱定質(zhì)量,用甲醇溶液補足減失質(zhì)量,0.22 μm微孔濾膜過濾備用。

3 結(jié)果與分析

3.1 基于HPLC-Q-TOF-MS/MS的蘇木配方顆?；瘜W(xué)成分定性表征

通過優(yōu)化裂解電壓、掃描參數(shù),確定最佳質(zhì)譜分析條件,對蘇木配方顆粒在正、負(fù)離子條件下進行檢測,總離子流圖如圖1所示。檢測結(jié)果表明:在負(fù)離子模式下蘇木配方顆粒的響應(yīng)值較高,特征吸收峰較多,因此,主要研究負(fù)離子模式下的化學(xué)成分以及推導(dǎo)負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律。通過對照品、參考文獻及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的比對分析,共鑒定了61個化合物:包括24個黃酮類成分、6個酚酸類成分、5個巴西蘇木素類成分、4個原蘇木素類成分、4個查爾酮類、4個高異黃酮成分、2個糖類成分、2個生物堿成分、3個二苯類成分、2個香豆素類、3個未知成分、1個苯丙素類和1個氨基酸;其中有12個化合物是首次在蘇木中鑒定的成分;化學(xué)成分信息結(jié)果如表1所示。按照成分的不同母核結(jié)構(gòu),將蘇木中的查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類化合物進行歸納總結(jié)(圖2),并將對這3類典型藥理活性化合物進行裂解規(guī)律解析。

表1 蘇木配方顆?；瘜W(xué)成分信息表

圖1 蘇木配方顆?？傠x子流圖

圖2 蘇木中查爾酮類、原蘇木素類和高異黃酮類成分的基本骨架

3.2 查爾酮化合物的裂解規(guī)律解析

查爾酮化合物被認(rèn)為是黃酮類化合物和異黃酮類化合物的前體,屬于芳香族烯酮類化合物,基本結(jié)構(gòu)為1,3-二苯基-2-烯-1-酮[29]。蘇木配方顆粒中共鑒定4個查爾酮類化合物,分別為化合物26,29,39,47。查爾酮類裂解時會有典型的中性丟失,包括H2O(18Da)、CO(28Da)等,同時會產(chǎn)生m/z為135[C8H7O2]-和91[C6H3O]-的典型碎片離子。B環(huán)取代基和位置均相同時區(qū)別在于A環(huán)取代基的類型和位置,從而影響裂解。對于B環(huán)上含有羥基取代的查爾酮類,由于間位羥基與環(huán)外的雙鍵以及羰基的共軛受阻,從而使得生成的負(fù)離子穩(wěn)定性不強,因而C-3羥基優(yōu)先丟失。若A環(huán)上連有甲氧基,甲氧基作為推電子基團,提高了B環(huán)的電子云密度,增強了共軛效應(yīng),因而相對穩(wěn)定,優(yōu)先丟失H2O(18Da),后續(xù)進一步脫去·CH3碎片離子且易與B環(huán)一起發(fā)生斷裂。受2′位置羥基的影響,B環(huán)易丟失,若A環(huán)上存在羥基,首先其氫重排后再失去CO(28Da)碎片離子,且取代基種類會影響碎片的豐度。

化合物29(Butein,紫鉚因)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為271.060 3[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,α裂解產(chǎn)生m/z為135.043 9[M-H-C7H4O3]-或91.020 9[M-H-C9H8O4]-的碎片離子,與化合物39的裂解途徑基本相似?；衔?9(Sappanchalcone,蘇木查爾酮)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z為285.075 8[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,B環(huán)失去一分子·CH3所產(chǎn)生的m/z為270.052 2[M-H-CH3]-,B環(huán)丟失得到m/z為161.023 2[M-H-C7H8O2]-的碎片離子。同時也有可能斷裂產(chǎn)生m/z約為135[C8H7O2]-或91[C6H3O]-的碎片離子。可能裂解途徑如圖3所示。

圖3 蘇木中查爾酮類在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律

3.3 高異黃酮類化合物的裂解規(guī)律解析

高異黃酮類是比異黃酮類的B、C環(huán)之間多1個亞甲基的特殊黃酮類,因亞甲基的存在容易導(dǎo)致C-3處的斷裂,從而產(chǎn)生失去B環(huán)的特征碎片離子[30]。取代基一般為—OH、—OCH3,共有8種類型,其中高異黃酮類(Ⅳ)的結(jié)構(gòu)特征為母體結(jié)構(gòu)為3-羥基二氫高異黃酮,A環(huán)7位為羥基取代;高異黃酮類(Ⅷ)的結(jié)構(gòu)特征為母體結(jié)構(gòu)是由A、B、C和D四環(huán)構(gòu)成,并且C-4沒有連接羰基。在蘇木中,根據(jù)C-4位取代基的不同而劃分為蘇木酮類和蘇木醇類。蘇木配方顆粒中共鑒定出4個高異黃酮類成分,分別為化合物9,13,18,25。高異黃酮類發(fā)生的中性碎片丟失如CO(28Da)、CH3(15Da)和H2O(18Da)等,生成m/z為135[C8H7O2]-、163[C9H7O3]-和179[C9H7O4]-等典型碎片離子。當(dāng)C環(huán)上有甲氧基取代時,則會產(chǎn)生中性丟失CH3(15Da),且優(yōu)于B環(huán)(Ⅷ型)發(fā)生丟失。當(dāng)C環(huán)上無甲氧基取代時,容易發(fā)生C環(huán)的斷裂,C環(huán)開環(huán)變?yōu)槲逶h(huán),以及A環(huán)本身也會發(fā)生裂解反應(yīng)。

化合物9(Episappanol,表蘇木醇)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為303.085 7[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,B環(huán)(Ⅳ)直接斷裂得到m/z為179.033 4[M-H-C7H8O2]-和123.044 2[M-H-C9H8O4]-的碎片,B環(huán)丟失,產(chǎn)生m/z為148.016 0[M-H-C8H10O3]-的亞穩(wěn)離子,經(jīng)誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生m/z為135.044 4[M-H-C8H7O4]-的碎片離子,失去一分子·CH2,所產(chǎn)生的m/z為121.021 9[M-H-C9H9O4]-?；衔?8(4-O-Methylsappanol,4-O-甲基蘇木素)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為317.076 4[M-H]-,失去一分子·CH3得到302.079 9[M-H-CH3]-,失一分子H2O得到284.065 6[M-H-CH3-H2O]-的碎片離子,C環(huán)開環(huán)斷裂得到m/z為135.044 2[M-H-C9H10O4]-的碎片離子?；衔?5(Sappanone B,蘇木酮B)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為301.071 1[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,B環(huán)(Ⅳ型)斷裂得到m/z為179.033 4[M-H-C7H6O2]-,和豐度較低m/z為135.044 7[M-H-C8H6O4]-的碎片離子。失去一分子CO后得到151.039 0[M-H-C8H6O3]-。m/z為179.033 8[M-H-C7H6O2]-失去·C2H2得到m/z為109.030 5[M-H-C10H8O4]-的碎片離子。化合物13(Brazilin,巴西蘇木素)在負(fù)離子模式下丟失一分子H得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為285.074 7[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,丟失一分子H2O,得到m/z為267.064 5[M-H-H2O]-的碎片離子,m/z為163.037 9[M-H-C7H6O2]-由六元環(huán)C環(huán)與五元環(huán)D環(huán)直接斷裂形成。丟失一分子CO,所產(chǎn)生的m/z為135.044 2[M-H-C8H6O3]-,同時也有可能C環(huán)開環(huán)斷裂產(chǎn)生m/z為121.028 9[M-H-C9H8O3]-和163.037 9[M-H-C7H6O2]-的碎片離子。易發(fā)生斷裂的母核位置以及可能裂解途徑如圖4所示。

圖4 蘇木中高異黃酮類在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律

3.4 原蘇木素類化合物的裂解規(guī)律解析

原蘇木素類是蘇木中特有的一類成分,它們具有一個基本的母核結(jié)構(gòu)。蘇木配方顆粒中共鑒定出4個原蘇木素類成分,分別為化合物7,11,15,40。其中,化合物21是化合物11的衍生物,化合物40由化合物7與化合物11聚合形成。原蘇木素類發(fā)生的中性碎片丟失主要以H2O(18Da)為主,且會產(chǎn)生特征碎片離子,其m/z為229[C13H9O4]-或211[C13H7O3]-。C環(huán)上的R基團并未與苯環(huán)共軛,因此性質(zhì)相對于其他環(huán)上的基團較為活潑,容易丟失。同時C環(huán)由于跨環(huán)張力,八元環(huán)相對不是很穩(wěn)定,易發(fā)生開環(huán)行為,或形成六元環(huán)化合物。當(dāng)C環(huán)上連有甲氧基時,則優(yōu)于其他R基團發(fā)生中性丟失,或者同時發(fā)生斷裂。

化合物11(Protosappanin B,原蘇木素B)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為303.086 7[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,丟失一分子H2O,得到m/z為285.076 6[M-H-H2O]-的碎片離子,C環(huán)斷裂成得到m/z為231.064 3[M-H-C3H4O2]-和243.064 8[M-H-C2H4O2]-的碎片離子,m/z為243.064 8[M-H-C2H4O2]-閉環(huán)得到m/z為211.039 1[M-H-C3H8O3]-的碎片離子?；衔?(Protosappanin C,原蘇木素C)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為301.069 6[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上,丟失一分子H2O,得到m/z為283.059 0[M-H-H2O]-的碎片離子,C環(huán)斷裂所生成的m/z為229.049 6[M-H-C3H4O2]-,丟失一分子H2O,得到m/z為211.038 8[M-H-C3H6O3]-的碎片離子?；衔?0(Protosappanin E1/E2,原蘇木素E1/E2)在負(fù)離子模式下丟失一分子H,得到的準(zhǔn)分子離子峰m/z為585.140 2[M-H]-,在準(zhǔn)分子離子峰的基礎(chǔ)上斷裂,得到m/z為283.060 0[M-H-C16H14O6]-的碎片離子,與化合物7中的m/z為283[M-H-H2O]-相吻合,C環(huán)開環(huán)斷裂形成m/z為229.049 4[M-H-C19H16O7]-的碎片離子。易發(fā)生斷裂的母核位置以及可能裂解途徑如圖5所示。

圖5 蘇木中原蘇木素類在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律

4 結(jié) 論

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)解析了蘇木配方顆粒中化學(xué)成分以及裂解規(guī)律。根據(jù)化合物的一級、二級質(zhì)譜信息,通過對照品、參考文獻及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的比對分析,共鑒別了61個化合物,包括24個黃酮類成分、4個原蘇木素類成分、4個高異黃酮類成分和4個查爾酮類成分等?？偨Y(jié)推導(dǎo)了查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類的質(zhì)譜裂解規(guī)律。查爾酮類主要的裂解途徑為脫掉中性分子以及丟失B環(huán),主要產(chǎn)生m/z為135[C8H7O2]-或91[C6H3O]-的特征碎片離子;高異黃酮類主要的裂解途徑為脫去H2O,脫去甲氧基、B環(huán)斷裂,產(chǎn)生m/z為135[C8H7O2]-、163[C9H7O3]-和179[C9H7O4]-等特征碎片離子;原蘇木素類主要的裂解途徑為脫去H2O、C環(huán)斷裂,產(chǎn)生m/z為229[C13H9O4]-或211[C13H7O3]-的特征碎片離子。還推導(dǎo)出了查爾酮類、原蘇木素類化合物在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律,并總結(jié)了3類化合物在負(fù)離子模式下的特征碎片離子,研究成果將有助于蘇木配方顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究,同時為該品種的科學(xué)質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

本文得到了浙江工業(yè)大學(xué)研究生實踐基地建設(shè)項目(GZ21231160006,GZ21881160011)的資助。