胎盤體外模型的研究進(jìn)展*

劉佳樂,漆洪波,張 華,陳 昶**

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院,重慶 400013;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科,重慶 400016)

胎盤位于母體和胎兒血管床之間,是妊娠期間胚胎、胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長成的母子間組織結(jié)合器官。胎盤對于維持胎兒的生命至關(guān)重要,其主要功能是進(jìn)行母胎之間的物質(zhì)交換和支持胎兒的生長發(fā)育[1]。胎盤發(fā)育障礙和功能缺陷與多種妊娠并發(fā)癥相關(guān),包括先兆子癇、早產(chǎn)、不明原因死產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)生長受限。因此,對于胎盤的研究可幫助了解相關(guān)妊娠并發(fā)癥的發(fā)病機制,為臨床診療提供幫助。

闡明胎盤的發(fā)育和功能具有重要意義,但由于倫理問題和不同物種間胎盤解剖和發(fā)育的巨大差異,動物模型僅能提供有限的關(guān)于人類胎盤的信息[2]。為了更詳細(xì)地研究人類胎盤的發(fā)育和功能,研究人員開發(fā)了多種體外模型,包括體外人胎盤小葉灌注模型以及近期開發(fā)的胎盤芯片、滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官培養(yǎng)模型。本綜述簡要描述人類胎盤生物學(xué),以及介紹以上3種模型的研究進(jìn)展。

1 人類胎盤生物學(xué)

人卵子和精子結(jié)合形成受精卵,到達(dá)子宮后轉(zhuǎn)化為囊胚,定植于子宮內(nèi)膜,胎盤的發(fā)育由此開始。植入前的囊胚分化成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層,囊胚在植入子宮內(nèi)表面上皮5～6d后,滋養(yǎng)外胚層迅速增殖并分化為細(xì)胞滋養(yǎng)層(cytotrophoblast,CT),隨后CT分化為合胞體滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblast,SCT)和絨毛外滋養(yǎng)層(extravillous trophoblast,EVT)。SCT是由CT融合形成的覆蓋在胎盤絨毛上的多核細(xì)胞,是母胎之間進(jìn)行氣體、營養(yǎng)交換和產(chǎn)生激素的主要場所。CT侵入子宮內(nèi)膜,形成EVT。EVT的作用是將胎盤固定在子宮上,并向子宮內(nèi)膜深部浸潤,形成細(xì)胞柱,使子宮螺旋動脈重塑以增加血流量[3]。除滋養(yǎng)層細(xì)胞外,胎盤內(nèi)還有滋養(yǎng)層巨細(xì)胞、霍夫鮑爾細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞等細(xì)胞,這些細(xì)胞對于胎盤的發(fā)育和功能也有重要意義[1]。

2 體外人胎盤小葉灌注模型

人胎盤小葉灌注模型是研究胎盤物質(zhì)轉(zhuǎn)運的重要工具。通常取產(chǎn)后的胎盤作為模型基礎(chǔ),不會對母體和胎兒產(chǎn)生傷害。Panigel等[4]于1967年首次描述了體外人胎盤小葉灌注模型,1972年由Schneider等[5]建立了體外人胎盤小葉雙重灌注模型。該模型經(jīng)過發(fā)展變化,可適用于包括藥代動力學(xué)、納米顆粒轉(zhuǎn)移、血管張力調(diào)節(jié)、分泌功能、病毒感染等方向的研究。模型通過灌流管連接同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈建立胎兒側(cè)循環(huán),另一灌流管插入螺旋動脈殘端建立母體側(cè)循環(huán),模式圖見圖1。Hutson等[6]指出,體外人胎盤小葉雙重灌注模型是預(yù)測妊娠后期胎盤藥物轉(zhuǎn)運的有效方法。近期有研究將灌注模型與數(shù)學(xué)建模結(jié)合,提高對胎盤功能的理解[7]。離體胎盤灌注模型也存在一些缺陷[7]:(1)建立在妊娠晚期的成熟胎盤上,無法用于妊娠早、中期胎盤轉(zhuǎn)運的研究。(2)建立過程復(fù)雜,成功率較低(15%～20%)。(3)模型難以長時間維持胎盤組織的活性。在大多數(shù)研究中,胎盤灌注時間只有2～6h,僅有部分能達(dá)到48h,無法研究藥物的慢性暴露。

3 胎盤芯片

Lee團(tuán)隊在2015年提出了胎盤芯片(Placenta-on-a-Chip)的方法,將微流控和微加工技術(shù)與胎盤滋養(yǎng)層絨毛膜癌細(xì)胞系培養(yǎng)相結(jié)合,用于模擬胎盤屏障的生理結(jié)構(gòu)[8]。這種微器件由兩個聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)微流體通道組成,利用薄細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)膜隔開人滋養(yǎng)層細(xì)胞(human trophoblastic cell lines JEG-3,JEG-3)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并進(jìn)行分區(qū)灌注共培養(yǎng),模式圖見圖2。該研究通過分析葡萄糖在模型上的轉(zhuǎn)運驗證其轉(zhuǎn)運功能,結(jié)果與先前報道的體內(nèi)研究結(jié)果一致。微流體系統(tǒng)能模擬胎盤屏障血流動力學(xué)微環(huán)境,而且該模型的雙層結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的2D平面結(jié)構(gòu)更接近胎盤屏障的生理結(jié)構(gòu)。研究人員利用該法研究了納米顆粒和咖啡因等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。2021年P(guān)u等應(yīng)用3D微流體胎盤芯片模型建立胎盤侵襲微環(huán)境,模擬滋養(yǎng)層細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在滋養(yǎng)層微環(huán)境中的相互作用,并應(yīng)用于毒理學(xué)測試[9]。2022年Mosavati等[10]在胎盤瘧疾和葡萄糖轉(zhuǎn)運研究中提到胎盤芯片模型中單向血流的局限性:子宮動脈血流是雙向的,應(yīng)在適當(dāng)剪切應(yīng)力下通過搖擺運動使模型變?yōu)殡p向流動,以模擬胎盤血液流動分叉。Richardson等[11]建立了三培養(yǎng)胎盤芯片模型,用3個PDMS微流控培養(yǎng)室分別培養(yǎng)SCT(毛喉素誘導(dǎo)BeWo融合形成)、CT(BeWo)和HUVEC,模擬胎盤滋養(yǎng)層-內(nèi)皮層雙層結(jié)構(gòu);測試了普伐他汀和瑞舒伐他汀在模型上的擴(kuò)散、代謝和效能,驗證了模型在研究胎盤藥代動力學(xué)方面的實用性。2022年6月,Deng等[12]建立了誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生滋養(yǎng)層干細(xì)胞(human Trophoblast stem cell,hTSC)方法與胎盤芯片結(jié)合的模型。該模型為微流體系統(tǒng)和ECM組成的3D培養(yǎng)室,允許hPSC衍生的hTSC分化為包含CT、SCT和EVT的滋養(yǎng)層樣組織。對動態(tài)環(huán)境培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的分析結(jié)果表明,剪切應(yīng)力能促進(jìn)hPSC衍生的hTSC分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。但與原代滋養(yǎng)層相比,該模型的滋養(yǎng)層樣組織的成熟度和功能還有一定差異。此外,培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步驗證。這是首個胎盤芯片與誘導(dǎo)hPSC衍生hTSC結(jié)合的模型,未來可能成為一種有力的胎盤研究工具。

圖2 胎盤芯片模式圖

Pemathilaka等[13]研究表明,胎盤芯片是非常實用的體外模型,可模擬胎盤動態(tài)生理環(huán)境,成本較低。Pemathilaka對胎盤芯片目前存在的挑戰(zhàn)進(jìn)行了總結(jié):(1)研究人員近幾年專注于模型的制造過程,僅對部分藥物的轉(zhuǎn)運進(jìn)行了研究,目前還缺乏胎盤生理特性方面的研究;(2)模型需要復(fù)雜的驗證測試和質(zhì)量控制;(3)模型所需的PDMS無法大規(guī)模制造。此外,PDMS對疏水性小分子的吸附能力,可能影響模型在藥物測試領(lǐng)域的應(yīng)用。研究認(rèn)為,用水凝膠替代PDMS可提升裝置的軟機械性能[14]。胎盤芯片可精準(zhǔn)控制胎盤物質(zhì)交換的各種關(guān)鍵參數(shù),但需要耐心和細(xì)致的細(xì)胞培養(yǎng),防止細(xì)胞污染影響研究結(jié)果。胎盤芯片模型剛剛起步,雖然還存在一些技術(shù)上的挑戰(zhàn),但這種應(yīng)用微工程技術(shù)解決問題的方法正在成為一種新的趨勢。

4 滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官培養(yǎng)

胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞對于人類胎盤發(fā)育和功能的研究至關(guān)重要,但之前的滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)模型主要使用原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞系。原代滋養(yǎng)層細(xì)胞難以分離純化,通常壽命有限且易發(fā)生表型變化;永生化細(xì)胞系則來源于絨毛膜癌(如Bewo、JAR和JEG-3等),雖然相對穩(wěn)定且易于獲取,但與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞存在差異[2]。2018年,研究人員開發(fā)了2D結(jié)構(gòu)的滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)模型[15]和3D結(jié)構(gòu)的人滋養(yǎng)層類器官模型[2],在胎盤滋養(yǎng)層體外模型研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了重大突破。

4.1 滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞來源于囊胚和植入后的胚胎外胚層,是分析小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞分子生物學(xué)的最佳體外模型。2018年Okae等從人CT和囊胚中分離出了hTSC細(xì)胞,建立了人胎盤滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)模型,為研究人類滋養(yǎng)層的發(fā)育和功能提供了重要工具[15]。

對原代滋養(yǎng)層的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)上皮干細(xì)胞增殖所必需的Wnt和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)信號通路相關(guān)基因在原代CT中表達(dá)最高,研究數(shù)據(jù)預(yù)測CT可能在其他上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)條件下保持增殖?；谵D(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,研究測試了各種可增強干細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)含有CHIR99021、EGF、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制劑、VPA和Y27632的培養(yǎng)基能實現(xiàn)CT細(xì)胞的長期培養(yǎng)。后續(xù)又對hTSC向EVT和SCT分化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)除了含CHIR99021的基礎(chǔ)培養(yǎng)基外,hTSC向EVT分化還需要NRG1、A83-01和基質(zhì)膠Matrigel。向SCT分化則需aAMP激動劑forskolin和EGF。培養(yǎng)出的增殖性CT具有分化為SCT和EVT的能力,因此被定義為CT來源的hTSC。該研究從妊娠早期胎盤中獲得了hTSC細(xì)胞,并能持續(xù)增殖至少5個月,但無法從足月胎盤中獲得此類細(xì)胞。該研究培養(yǎng)的hTSC和分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、甲基組具有許多滋養(yǎng)層細(xì)胞特征[16],并且與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞高度相似。將hTSC植入非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)-重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency mice,SCID)小鼠,發(fā)現(xiàn)可模仿滋養(yǎng)層侵入過程。最近有研究實現(xiàn)了從足月胎盤中獲得hTSC[17],該研究表明ΔNp63α與GCM1之間存在拮抗作用,發(fā)現(xiàn)缺氧和使用EGF/CASVY上調(diào)ΔNp63α活性抑制GCM1表達(dá),可促進(jìn)CT轉(zhuǎn)化為hTSC。

近期出現(xiàn)了另一種獲得hTSC的方法:誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生hTSC。hPSC包括人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC),hiPSC由成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的重編程產(chǎn)生[18]。Castel等[18]研究中描述了將人體細(xì)胞重編程為hiPSC再衍生hTSC的路線圖。數(shù)個研究已實現(xiàn)了從幼稚hPSC誘導(dǎo)產(chǎn)生hTSC,而有爭議的是從始發(fā)態(tài)hPSC誘導(dǎo)hTSC過程中需要使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)處理,但這可能導(dǎo)致羊膜標(biāo)志物活化,使誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞更接近羊膜譜系[19]。研究發(fā)現(xiàn),C19MC miRNA表達(dá)對hTSC干性的維持非常重要,但始發(fā)態(tài)hPSC衍生的hTSC并不表達(dá)大多數(shù)C19MC miRNA[20],并且在始發(fā)態(tài)hPSC衍生的hTSC中重新激活C19MC miRNA的表達(dá),也無法恢復(fù)其增殖和分化潛力。Jang等[21]研究表明,經(jīng)短期BMP4處理的始發(fā)態(tài)hPSC可誘導(dǎo)為hTSC,與真正的hTSC具有相似的表達(dá)譜,并且在長期培養(yǎng)中具有自我更新和分化能力。Cui等[22]研究中,實現(xiàn)了誘導(dǎo)始發(fā)態(tài)hPSC在3D ECM培養(yǎng)下形成滋養(yǎng)層樣組織,并發(fā)現(xiàn)了生理微環(huán)境對滋養(yǎng)層分化的重要性。Wei等[23]報道了BMP4顯著增強從始發(fā)態(tài)hPSC誘導(dǎo)生成hTSC這一過程,以及敲除H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH1/2)可提高誘導(dǎo)效率。在上文關(guān)于胎盤芯片模型的介紹中,提到了滋養(yǎng)層干細(xì)胞與芯片模型結(jié)合,用于研究動態(tài)環(huán)境對hPSC誘導(dǎo)為hTSC的影響[12]。

hTSC表達(dá)多種轉(zhuǎn)運蛋白,這表明它們可作為研究胎盤轉(zhuǎn)運和代謝活性的模型[23]。但是滋養(yǎng)層干細(xì)胞模型無法模擬滋養(yǎng)層細(xì)胞的3D組織結(jié)構(gòu),于是研究人員開發(fā)了下述的3D滋養(yǎng)層類器官模型。

4.2 滋養(yǎng)層類器官 與干細(xì)胞培養(yǎng)模型相比,類器官在解剖和功能上更接近活體的器官。Haider等[24]從純化的妊娠早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中,建立了可自我更新的3D滋養(yǎng)層類器官。研究人員從妊娠6～7周的胎盤中分離純化出CT細(xì)胞,在特定條件下進(jìn)行培養(yǎng),幾天內(nèi)便形成小細(xì)胞團(tuán),并在2～3周內(nèi)迅速增殖發(fā)育成不規(guī)則的器官樣物質(zhì)。類器官大約每14d傳代1次,并且可連續(xù)傳代超過5個月。培養(yǎng)條件包括抑制TGF-β和BMP信號傳導(dǎo)的A83-01和Noggin、EGF,激活Wnt信號的R-spondin,糖原合成酶激酶3α和3β(GSK-3α/β)抑制劑CHIR99021,以及前列腺素E2。該研究對培養(yǎng)物進(jìn)行了分析,表明類器官細(xì)胞與人原代CT細(xì)胞的特性、干性、增殖標(biāo)志物以及基因表達(dá)高度相似。

Turco等[2]開發(fā)了用于研究胎盤形成過程中母胎相互作用的滋養(yǎng)層類器官模型。該模型比Haider等[24]的模型更完善,培養(yǎng)物可長期增殖,遺傳穩(wěn)定且具有定向分化能力。Turco等研究了妊娠6～8周時滋養(yǎng)層的信號通路,設(shè)計出由EGF、FGF2、CHIR99021、A83-01和Rspondin-1組成的基礎(chǔ)滋養(yǎng)層有機介質(zhì)(TOM),后續(xù)又向TOM中添加了HGF、PGE2和Y-27632,發(fā)現(xiàn)CT在該培養(yǎng)條件下能在第二次傳代后(10～14d內(nèi))形成均勻的滋養(yǎng)層類器官。研究發(fā)現(xiàn)EGF對于CT的增殖最重要,其次是Y-27632、A83-01和CHIR99021。該研究描述了SCT融合和人滋養(yǎng)層類器官形成過程,并且證明了該類器官在解剖和功能上與體內(nèi)胎盤非常相似,還討論了HLA-G+EVT的分化與侵襲作用。2020年,在Turco的方法基礎(chǔ)上,Sheridan等[25]對其進(jìn)行了改進(jìn),并討論了與之前方法的區(qū)別。該研究在TOM中添加FGF2和Y-27632并去除Noggin,可增強細(xì)胞的增殖和存活率,EVT分化改為hTSC模型研究中的方法[15]。該培養(yǎng)方法傳代時間更短,僅需7～10d,且能連續(xù)傳代一年以上。

近兩年滋養(yǎng)層類器官逐漸開始應(yīng)用于胎盤研究領(lǐng)域。Xu等設(shè)計了基于人滋養(yǎng)層類器官的高通量免疫熒光篩選方法,篩選和鑒定常用有機磷酸鹽阻燃劑(organophosphorus flame retardants,OPFRs)中破壞胎盤的化學(xué)物質(zhì)[26]。Kreis使用滋養(yǎng)層類器官模型研究了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21及其基因家族中的p27和p57在胎盤發(fā)育和子癇前期發(fā)病中的作用[27]。Sheridan等[25]表明,滋養(yǎng)層類器官不僅可用于研究滋養(yǎng)層的發(fā)育和功能,還可用于胎盤產(chǎn)物的分析。Sheridan等研究中提到了滋養(yǎng)層類器官的局限性:目前無法從足月胎盤中獲得滋養(yǎng)層類器官,而且類器官中沒有基質(zhì)、內(nèi)皮和骨髓來源的胎盤細(xì)胞。

目前已經(jīng)有將干細(xì)胞和類器官兩種方法結(jié)合的模型——干細(xì)胞衍生的類器官模型[28]。最新研究發(fā)現(xiàn),幼稚hPSC來源的hTSC也能形成滋養(yǎng)層類器官[29],這種類器官具有與之前滋養(yǎng)層類器官相當(dāng)?shù)慕M織結(jié)構(gòu)、胎盤激素分泌和長期自我更新的能力。該研究證明了類器官中多種細(xì)胞的滋養(yǎng)層身份和分化能力,表征了從幼稚hiPSC到建立類器官過程中的X染色體失活動力學(xué),并用該模型探討了胎盤發(fā)育和對不同病原體的易感性。滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官模型培養(yǎng)的細(xì)胞與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞的表達(dá)譜差異較小,細(xì)胞合成分泌功能接近,未來可作為研究胎盤合成分泌功能的理想模型。滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官細(xì)胞培養(yǎng)模式圖見圖3。

圖3 滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官培養(yǎng)過程示意圖

5 討 論

體外人胎盤小葉灌注模型在胎盤屏障功能、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和胎兒藥物暴露等研究方向有成熟的應(yīng)用。其最大的優(yōu)勢是擁有完整的人類胎盤結(jié)構(gòu),在解剖學(xué)上最接近生理狀態(tài)。但其缺點在于無法用于胎盤早、中期的研究,且操作復(fù)雜,難以開展標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；芯?。胎盤芯片能模擬胎盤的部分多層結(jié)構(gòu)和屏障功能,且可提供其他細(xì)胞培養(yǎng)模型缺少的胎盤動態(tài)環(huán)境,實驗程序相對簡易且重復(fù)性良好,更適合用于孕早、中期胎盤的屏障和轉(zhuǎn)運功能研究(如高通量藥物轉(zhuǎn)運研究),但不太適用于研究胎盤的發(fā)育過程和分泌功能。相反,滋養(yǎng)層干細(xì)胞和類器官的生理特性更接近原代滋養(yǎng)層細(xì)胞,更適用于研究胎盤的發(fā)育過程和分泌功能,但由于其結(jié)構(gòu)難以區(qū)分母體面和胎兒面,因此暫不適用于研究胎盤的屏障和轉(zhuǎn)運功能。

本文介紹了三種胎盤體外模型的發(fā)展和應(yīng)用,以及目前存在的局限性。綜上所述,三種模型各有優(yōu)缺點,在應(yīng)用領(lǐng)域方面形成互補,可根據(jù)具體研究目的選擇合適的胎盤體外模型。隨著分子生物學(xué)和生物工程等技術(shù)的快速發(fā)展,胎盤體外模型將不斷創(chuàng)新和優(yōu)化,為該領(lǐng)域的研究帶來廣闊前景。