‘紅地球’與‘金星無核’葡萄雜交群體果實香氣物質遺傳分析

朱駿馳，郭印山，郭修武*

（1. 上海農林職業(yè)技術學院植物科學技術系，上海 201699；2. 沈陽農業(yè)大學園藝學院，遼寧沈陽 110866）

葡萄屬多年生落葉藤本植物，不同地域的地理條件和自然環(huán)境促成了葡萄品種多樣化，并已開發(fā)出很多配套的栽培技術。隨著葡萄經濟價值不斷被發(fā)掘，現代葡萄種植產業(yè)高度發(fā)達，鮮食葡萄及加工后的葡萄干、葡萄酒等產品備受人們的青睞[1]。

隨著葡萄種植技術的不斷發(fā)展，葡萄種質資源持續(xù)改良。草莓香型、玫瑰香型是葡萄的兩種典型香型，具有較高的經濟價值[2-3]。一般認為，香氣物質多數作為數量性狀，在遺傳上由多基因控制，少數表現為受一對或多對基因控制的質量性狀[4]。本試驗使用固相微萃取技術與氣相色譜質譜聯用儀，通過構建雜交群體檢測種間雜交后代香氣物質及分析草莓香型香氣物質遺傳特點，為草莓香型葡萄新品種選育及香氣物質的相關基因篩選提供表型數據基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以親本‘紅地球’（母本）與‘金星無核’（父本）及種間雜交后代為試材，后代未經人為選擇。2008年5月進行雜交，秋季選取飽滿及無霉菌感染的雜交種子，同年10月至2009年2月進行層積處理，3月對雜交種子進行催芽處理及溫室營養(yǎng)缽點播，4—6月進行移栽定植和掛牌標記，2012年以后大部分實生苗結果，現所有試驗材料均定植于沈陽農業(yè)大學葡萄試驗基地（41°50′24″N，123°24′41″E），長勢良好。雜交后代群體共有531株，隨機選取其中183株連同親本用于本研究。由于試材果實成熟期不同，用果實糖度含量與種子呈褐色作為果實成熟鑒別依據。為了避免過早或過晚采集樣品，每72 h對樣本成熟度進行田間調查，一般在8月下旬至10月上旬陸續(xù)采集。

果實采集時，兼顧陰陽面每一樣品植株取3穗果，每穗隨機取20個成熟度一致且無機械損傷的果實，按照相同采樣標準重復3次。摘取的果實放入提前做好標記的自封袋中，在經液氮速凍后，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆肹5]。2016年采集共計151份材料包括149個結果后代單株與兩個親本，2017年采集共計161份材料包括159個結果后代單株與兩個親本，進行香氣測定與分析。

1.2 儀器與設備

氣相色譜質譜聯用儀器（GC-MS）；氮氫空一體機（Nitrogen-hydrogen Air Machine）；SPME手柄及萃取頭；榨汁機；多功能恒溫攪拌器。

1.3 試驗方法

葡萄果實中香氣物質成分及含量通過NIST11標準質譜庫匹配及標準品制備標準曲線后進行定性定量分析，試驗中設置的固相微萃取條件以李志文等[6]的方法為參考。萃取步驟：將低溫保存的葡萄樣品化凍至室溫，在每一樣品中稱取30～40 g作為萃取樣品，剔除果實中的種子與果梗，用榨汁機榨汁，抽取8 mL樣品放入離心管離心5 min，轉入容量為20 mL頂空瓶內攪拌，加入干燥后的磁力與3.0 g NaCl后混勻密封；將SPME萃取頭輕緩插入頂空瓶后推出石英纖維；樣品加熱至60 ℃，以950 r·min-1的速度進行磁力攪拌；靜置吸附40 min，回抽石英纖維和萃取頭，轉入氣相色譜進樣口；加溫至250 ℃，完全干燥后用儀器解析5 min，同步記錄所有數據。試驗中采用的進樣口以無分流模式為主，萃取頭在使用前經1 h的270 ℃高溫老化處理。

G C 分析：繪制色譜柱V F-Wa x m s 毛細管柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），注入高純度He，在流速為1 mL·min-1下通過250 ℃的進樣口，不分流手動進樣，解析5 min。溫控步驟：先將初始溫度調整為60 ℃，持續(xù)3 min，按照3 ℃·min-1的升溫速度提至120 ℃，保持2 min，再按5 ℃·min-1的速度升至210 ℃，保持5 min。

MS條件：GC-MS傳輸線250 ℃、EI離子源200 ℃，電子能量70 eV、廣電倍增管電壓為350 V，在荷質比（m/z）45～600 amu范圍內啟用全掃描模式。

1.4 數據處理

質譜圖采集結束后，在系統(tǒng)中打開N I S T Chemistry WebBook，在信息檢索欄查找相關測試數據，將質譜圖中的數據與檢索得到的數據進行對比，評測匹配程度以確定香氣中的物質成分。采用SIMCA 14.1統(tǒng)計分析軟件中PCA分析模塊確定香氣物質中的主成分，并繪制香氣成分中的標準品主成分曲線，采用定量分析法解析香氣成分。

采用Excel 2019對親中值、子代均值和變異系數等相關遺傳指標進行統(tǒng)計計算，相關計算公式參照《果樹育種學》及相關文獻[7-9]計算方法。

2 結果與分析

2.1 兩品種雜交后代香氣物質鑒定

從親本的香氣成分數據對比上看，水楊酸甲酯、大馬士酮、苯乙醇、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯的含量不同是造成親本葡萄果實樣品香氣成分差異的主要原因，分別對應出峰時間為25.851、28.312、31.144、40.484、45.546 min。

2.2 兩品種雜交后代酯類香氣物質的遺傳分析

圖1為3種主要的酯類香氣物質（水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二甲酯和鄰苯二甲酸二丁酯）在親本及雜交后代中含量分布情況?？梢钥闯?，在2016、2017兩年試驗中3種酯類香氣物質遺傳存在相似性，即酯類香氣物質在父本‘金星無核’中的含量均高于在子代中的含量，絕大多數子代中的含量高于母本‘紅地球’中的含量。

圖1 在親本和雜交后代中酯類香氣物質含量分布Figure 1 Content distribution of ester aroma compounds in parental and hybrid progeny

由表1可以看出，連續(xù)兩年的各酯類香氣物質的變異系數范圍在123.2%～251.4%，可以看出雜交后代酯類香氣物質分離趨勢廣泛，選擇潛力大。遺傳傳遞力最小為2017年鄰苯二甲酸二甲酯的116.7%，最大為2017年鄰苯二甲酸二丁酯的197.8%，且超低親率明顯高于超高親率，在遺傳效應上呈現典型的趨小性遺傳特征。

表1 ‘紅地球’和‘金星無核’及雜交后代中各香氣物質的遺傳變異Table 1 The hereditary variation of aroma compounds in 'Red Globe' 'Venus Seedless' and their hybrids%

2.3 兩品種雜交后代大馬士酮香氣物質的遺傳分析

大馬士酮是異戊二烯代謝合成途徑產生的葡萄果實香氣組分，具有花香、木瓜等氣味特征，雖然含量較低但受到其低閾值的影響，對葡萄及葡萄酒豐富的花果香味具有重要的貢獻[10-11]。有研究表明，大馬士酮可以通過與葡萄及葡萄酒中其他香氣成分互作，增強果香[12-14]。

本試驗中大馬士酮香氣物質全部遺傳到所有雜交后代中，屬于連續(xù)變量的數量性狀遺傳。通過圖2可以看出，其遺傳特點兩年大體上一致，即父本‘金星無核’中大馬士酮的含量均高于子代的中間值，母本‘紅地球’中大馬士酮的含量小于絕大多數子代中的含量，其中2016年大馬士酮在母本‘紅地球’中的含量小于所有子代中的含量。

圖2 在親本和雜交后代中大馬士酮含量分布Figure 2 Content distribution of damascenone in parental and hybrid progeny

通過表1可以看出大馬士酮兩年的變異系數分別為228.9%和157.4%，且2016年親本與子代葡萄果實中大馬士酮含量均值低于2017年（圖2），2017年含量分布范圍更廣表明雜交后代大馬士酮香氣物質分離趨勢大，選擇潛力大。大馬士酮遺傳傳遞力兩年平均為53.7%，超高親率兩年均大于50%，顯著高于超低親率（13.4%和15.5%），說明大馬士酮香氣物質遺傳給雜交后代的能力比較強，在遺傳效應上呈現典型的趨大性遺傳特征。

2.4 兩品種雜交后代苯乙醇香氣物質的遺傳分析

苯乙醇是一種從植物資源中發(fā)現的芳香族化合物，在蘋果、獼猴桃、桃、樹莓、葡萄等多種果樹中均有發(fā)現，具有清甜的花香味，被廣泛應用于調味料和化妝品中[15-19]。通過表1可以看出，苯乙醇兩年的變異系數均值為223.5%，遺傳傳遞力都不低于130.1%。兩年間超低親率分別為37.3%和62.6%，遠高于超高親率，在遺傳效應上呈現典型的趨小性遺傳特征。

苯乙醇在雜交后代出現了分離的遺傳表現，2016年和2017年分別在86個和85個雜交后代中檢測到了苯乙醇香氣物質，在后代群體中分別占比57.7%和53.5%，經卡方檢驗計算求得卡方值分別為3.55和0.76，均小于P值3.84，說明苯乙醇符合質量性狀的遺傳規(guī)律。兩年間苯乙醇在父本‘金星無核’中的含量均遠高于子代含量的中間值（圖3），但在母本‘紅地球’中的含量2016年遠低于子代含量的中間值，2017年略高于子代含量的中間值，表明兩年間苯乙醇在雜交后代中表現出了不完全相同的遺傳特點。

3 討論與結論

葡萄雜交育種過程中，受親本基因正向及反向的影響，后代雜交性狀廣泛分離，形成一些超高親植株，這也正是有性雜交的意義[20-22]。

葡萄香氣是近年來消費者最在意的性狀之一，也是重要的商品指標。葡萄的草莓香味，也稱狐香，主要在美洲種及歐美雜交后代的果實中存在，這種獨特香味的形成與多種酯類揮發(fā)性物質及降異戊二烯類物質有關[23-25]。目前，有關香氣物質遺傳規(guī)律研究多數選用玫瑰香型葡萄為試材，關于草莓香型葡萄特征香氣物質遺傳規(guī)律的研究報道相對較少。郭印山等[26]對以玫瑰香型葡萄品種‘87-1’為親本構建的雜交群體進行研究，發(fā)現主要香氣物質萜稀類化合物在雜交后代呈廣泛分離，其中香葉醇在遺傳效應上呈典型的增強變異，部分香氣物質受環(huán)境影響較大。劉若瑾等[27]認為，26種單萜化合物是構成玫瑰香型葡萄的主要香氣物質，雜交后代中果實香氣物質種類基本相同，在含量上有巨大差異，導致不同單株的果實香氣產生差別。曹亞平[28]研究發(fā)現，無香型葡萄品種‘京秀’與草莓香型葡萄品種‘布朗無核’的雜交后代中僅有11.1%呈現草莓香型，大部分均為無香型。孫婷[29]研究認為，草莓香型葡萄主要香氣物質為酯類化合物，種間雜交后代大部分的酯類香氣物質呈低親遺傳效應。

本研究剖析了以‘紅地球’和‘金星無核’葡萄雜交F1代果實中5種主要香氣物質遺傳規(guī)律。發(fā)現5種主要香氣物質變異系數均大于100%，后代出現廣泛分離，選擇潛力大，其中大馬士酮2016年的變異系數最大，選擇潛力最大。水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯在父本中的含量遠高于母本，且在后代中出現了連續(xù)的變異，平均遺傳力為153.2%，符合數量性狀遺傳特點。親本均值高于大部分雜交后代果實中酯類化合物的含量，呈現趨低遺傳。何明茜[30]研究草莓香型香氣物質遺傳特點時也發(fā)現，酯類化合物在草莓香型親本中含量遠高于無香型親本品種，少數酯類化合物如苯甲酸乙酯等有超親遺傳的現象，這些結果的不同可能是因為親本遺傳背景及試材地點氣候的差異，說明葡萄酯類化合物遺傳是非常復雜的。

在研究中也發(fā)現了大馬士酮和苯乙醇對草莓香型香味的形成貢獻率較高，并且連續(xù)兩年大多數子代中大馬士酮的含量高于親本，在后代中也出現了連續(xù)變異，且超高親率均超過50%，表現為趨大的遺傳傾向。

苯乙醇在后代群體中檢測到的比率分別為57.7%和53.5%，通過卡方適合性檢驗計算，檢測出苯乙醇的次數與理論分離比例為1∶1，符合質量性狀不連續(xù)變異的遺傳特點。李坤等[31]研究歐美雜交品種‘紫珍香’自交后代中發(fā)現，香氣成分苯乙醇也符合質量性狀的遺傳特點。

遼寧沈陽屬北溫帶大陸性氣候，氣候溫和，雨量適中，光照充足，且秋季晝夜溫差較大，有利于優(yōu)質葡萄的生產。結合沈陽氣象局公布的氣象數據，2017年沈陽降水量為463.8 mm，不足2016年967.9 mm的一半，為枯水年，日照時數與平均氣溫均多于2016年，表明不同年份間氣候的差異對降異戊二烯香氣物質的合成積累產生了一定的影響。2017年大馬士酮在親本中的含量相比2016年顯著增加，表明干旱、炎熱的年份對大馬士酮的積累有積極的作用[32]。Xie等[33]研究發(fā)現，葡萄果實大馬士酮的含量受溫度、濕度、日照時長及無霜天數等的強烈影響。此外也有研究表明，干旱、摘葉、整形方式及果實大小等因素均影響葡萄果實中香氣物質大馬士酮的積累[34-37]。

綜上所述，育種者可以從雜交后代中挑選一些草莓香型香氣物質高于親本的優(yōu)系個體進一步選育，同時也更應該關注草莓香型特征香氣物質的遺傳規(guī)律。