基于廣泛靶向代謝組學的‘品麗珠’葡萄轉色中果皮差異代謝物分析

丁亭亭，蘇東平，杜宜龍，陳景輝，趙紅軍，孫磊，王鵬飛,6*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 煙臺科技學院，山東煙臺 265600；3. 蓬萊國賓葡萄酒莊有限公司，山東煙臺 265600；4. 中糧長城葡萄酒（蓬萊）有限公司/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，山東煙臺 265600；5. 北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所，北京 100093；6. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，山東濟南 250100）

葡萄果皮顏色的變化是成熟過程中的重要指標之一，花色苷隨著果實的成熟進程逐漸積累并穩(wěn)定在較高水平。而果皮顏色是由果皮中花色苷的種類和比例決定的[1]。同時，花色苷還具有重要的營養(yǎng)和藥理作用，具有抗氧化、預防心血管疾病和抗腫瘤等多種保健功能[2-4]。葡萄中花色苷的生物合成可分為苯丙烷類代謝途徑、類黃酮途徑及花色苷合成途徑3個階段[5-6]。在苯丙烷類代謝途徑中，在苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶和4-香豆酰CoA連接酶作用下合成花色苷前體物質(zhì)——對香豆酰-CoA[7]。在類黃酮途徑中，查爾酮合成酶、查爾酮異構酶和黃烷酮-3-羥化酶將對香豆酰-CoA轉化為花色苷合成關鍵前體物質(zhì)二氫黃酮醇。在花色苷合成途徑中，二氫黃酮醇還原酶、無色花色素雙加氧酶及花青素合成酶催化二氫黃酮醇轉化為花白素，最后合成未修飾的花青素，再經(jīng)過糖基化等修飾反應，形成不同結構的花色苷[8]，這種二次修飾決定了葡萄果皮的顏色。通常葡萄果皮中的花色苷以錦葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-p-香豆酰葡萄糖苷、錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷為主[9]。花色苷屬于多酚物質(zhì)，葡萄中的多酚物質(zhì)還包括酚酸類、黃烷酮醇類、黃酮醇類、黃烷醇類（例如兒茶素、表兒茶素）、芪類化合物（例如白藜蘆醇）等[10-11]。

在葡萄成熟過程中，果實中的其他成分也發(fā)生著復雜的變化，例如果實中的糖分不斷積累[12]，酸度不斷減退。葡萄果實中積累的糖主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖等[13]；酸可分為有機酸和無機酸兩種，有機酸以酒石酸、蘋果酸及檸檬酸為主[12,14]。而糖、酸的種類和含量以及糖酸比決定著成熟葡萄的風味[15]。

雖然前人對葡萄成熟過程中的代謝產(chǎn)物含量變化做了大量研究，但是針對轉色前到轉色前期這一過程果皮的代謝產(chǎn)物變化沒有細致的研究。尤其是針對葡萄膨大到轉色這個階段，果皮中花色苷種類和含量變化的研究鮮有報道。在轉色前葡萄果皮的顏色為綠色，但是花色苷合成是否已經(jīng)開始尚不明確。果皮中糖、酸、黃酮、芪類等營養(yǎng)物質(zhì)的積累狀況也鮮有報道。因此，本團隊利用廣泛靶向代謝組調(diào)查葡萄轉色前約4周、轉色前約1周和轉色前期‘品麗珠’葡萄果皮中代謝產(chǎn)物的積累和變化，旨在明確葡萄果皮轉色過程中產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的分子機理，為深入研究葡萄果實成熟的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

2019年在山東省葡萄研究院葡萄種質(zhì)資源圃采集‘品麗珠’葡萄轉色前約4周（S1）、轉色前1周（S2）和轉色前期（S3）形狀、大小均一，無病蟲害、無損傷的果實，每個時期分別采3穗果實樣品（圖1）。洗凈擦干后，在液氮速凍狀態(tài)下剝?nèi)」とス猓?80 ℃下保存待用。每組樣品3個生物學重復。

圖1 不同發(fā)育階段的‘品麗珠’葡萄果實Figure 1 'Cabernet Franc' fruit at different stages of development

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄果皮前處理

取0.10 g葡萄果皮在凍干機（Scientz-100F）中進行真空冷凍干燥，隨后用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨振蕩（30 Hz，1.5 min）成粉末。加入0.6 mL 70%甲醇提取液，渦旋振蕩儀振蕩混勻，溶解后的樣品放在4 ℃冰箱靜置過夜，中間渦旋振蕩混勻6次，以提高提取效率。第2天，4 ℃離心機10 000 r·min-1高速離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾，保存于棕色進樣瓶中，用于后續(xù)UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜質(zhì)譜方法

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)包括超高效液相色譜儀（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。色譜柱是Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相A是包含0.04%乙酸的超純水，流動相B是加入0.04%乙酸的乙腈溶液。流速為0.35 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量添加4 μL。

質(zhì)譜條件：使用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems 4500 QTRAP）測定；電噴霧離子源（ESI）溫度設置為550 ℃，質(zhì)譜電壓設置為5500 V，簾氣（CUR）設置為30 psi，碰撞誘導電離（CAD）參數(shù)設為高。

1.2.3 代謝物定性與定量分析

參照Yang等方法進行[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

基于武漢邁維科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫（Metawaredatabase，MWDB），依據(jù)二級譜信息數(shù)據(jù)庫對代謝物質(zhì)進行定性分析。采用多元統(tǒng)計分析方法，對3組樣品進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（PLSDA）法預測模型的可靠性。選取其中Log2FC≥1和Log2FC≤-1、變量權重值（Variable important in projection，VIP）≥1、P（P value）≤0.05的代謝物被鑒定為差異代謝物。將其中的差異代謝物數(shù)據(jù)提交到KEGG數(shù)據(jù)庫[17]，進行相關注釋和通路類型分類。使用KOBAS 2.0軟件 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進行KEGG富集分析。

2 結果與分析

2.1 代謝組成分總體分析

在3個取樣期的果皮中，共鑒定出29類416種代謝物（表1），其中S1果皮的代謝組成分有29類394種，特有的化學物質(zhì)有1類1種，即1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿；S2果皮的代謝組成分有29類401種，特有的化學物質(zhì)有2類2種，即丙氨酰亮氨酸和2-苯乙胺；S3果皮的代謝組成分有29類397種，特有的化學物質(zhì)有4類14種，包括DL-多巴、矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、甲基花青素-3,5-二葡糖糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-(乙?；?葡糖苷、金圣草黃素、7-O-蕓香糖苷麥黃酮、5-O-蕓香糖苷和異鼠李素（表1）。

表1 三個取樣期葡萄果皮中代謝物數(shù)量統(tǒng)計Table 1 Statistics of metabolites in grape pericarp in three sampling periods

2.2 不同著色期葡萄果皮代謝組主成分分析結果

通過對樣品進行主成分分析（PCA），判斷S1、S2和S3期葡萄果皮各組樣品之間的總體代謝物差異和組內(nèi)樣品之間的變異度大小。其中PC1的貢獻率為55.4%，PC2的貢獻率為11.21%，且3組樣本在二維圖上表現(xiàn)出明顯的分離趨勢（圖2），在PCA結果上能夠從總體上反映出3組樣品之間的代謝物差異。

圖2 三組樣品及質(zhì)控的PCA結果Figure 2 PCA plot for discrimination of three groups of samples and quality control

2.3 不同著色期果皮主要差異代謝成分分析

分別對S1、S2和S3期果皮樣品中代謝成分定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化進行兩兩比較，三個比較組果皮差異代謝物分別為32個（S1 vs S2）、195個（S1 vs S3）和186個（S2 vs S3）；其中，S1 vs S2獨有差異代謝物4個，S1 vs S3獨有28個，S2 vs S3獨有19個；3個比較組共有差異代謝物20個。對影響葡萄果實品質(zhì)的代謝物質(zhì)如花青素、糖及有機酸進行分析，其中花青素的變化個數(shù)分別為8個（S1 vs S2）、22個（S1 vs S3）和23個（S2 vs S3）；糖類變化個數(shù)分別為1個（S1 vs S2）、9個（S1 vs S3）和7個（S2 vs S3）；有機酸變化個數(shù)為1個（S1 vs S2）、7個（S1 vs S3）和7個（S2 vs S3）。

將差異倍數(shù)進行處理轉化為log2FC，從中選出變化倍數(shù)最大的前10個上調(diào)和下調(diào)的差異表達代謝成分進行分析（圖3）。與S1期果皮相比，S2期果皮中5種花青素（芍藥素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(乙酰基)葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-對香豆酰)-5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷、甲基花青素-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷），3種氨基酸及其衍生物（丙氨酰亮氨酸、氨基乙酰基異亮氨酸、DL-高半胱氨酸），1種酚酸類（鄰苯三酰-β-D-葡萄糖），1種其他類（2-苯乙胺）的相對含量顯著增加；3種氨基酸及其衍生物（β-煙酰胺單核苷酸、煙草胺、L-胱硫醚），1種有機酸（L-(+)-酒石酸），1種黃烷醇類（沒食子酸），1種黃酮（芹菜素O-己糖基-O-蕓香糖苷），1種查耳酮（根皮素），1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖），1種酚酸類（1-阿魏酰-sn-甘油）和1種磷脂酰膽堿（甘磷酸膽堿GPC）的相對含量顯著降低。

圖3 三個比較組代謝物差異倍數(shù)柱狀圖（差異倍數(shù)最大）Figure 3 The most significant different metabolite multiples of three comparison groups

與S1期果皮相比，S3期果皮中9種花青素（錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、錦葵色素O-己糖苷、甲基花青素-3-(乙酰基)葡糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、矢車菊素半乳糖苷）和1種黃酮（麥黃酮5-O-蕓香糖苷）的相對含量顯著增加；4種氨基酸及其衍生物（N-丙酰甘氨酸、(-)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸、L-胱硫醚、L-高胱氨酸）、3種酚酸類（對香豆酸、香豆酸、5-羥甲基糠醛）、2種有機酸（L-(+)-酒石酸、馬來酸）和1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖）的相對含量顯著降低。

與S2期果皮相比，S3期果皮中8種花青素（矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-(乙?；?葡糖苷）和2種黃酮（金圣草黃素7-O-蕓香糖苷、麥黃酮5-O-蕓香糖苷）的相對含量顯著增加；5種氨基酸及其衍生物（N-丙酰甘氨酸、丙氨酰亮氨酸、(-)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸、黃嘌呤、L-高胱氨酸），2種酚酸類（香豆酸、5-羥甲基糠醛），1種有機酸（L-(+)-酒石酸），1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖），1種其它（2-苯乙胺）的相對含量顯著降低。

2.4 不同著色期果皮差異代謝物通路富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對S1、S2和S3三個時期差異代謝物質(zhì)進行通路富集分析。對S1 vs S2鑒定出的32種顯著差異代謝物進行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前17條主要涉及類黃酮的生物合成、次生代謝物的生物合成、二苯乙烯、二芳基庚酸類和姜酚合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝及異黃酮的生物合成。其中，次生代謝物和類黃酮生物合成途徑富集差異代謝物較多，富集程度顯著，表明轉色前4周到轉色前1周果皮中的差異代謝物主要參與次生代謝物和類黃酮的生物合成（圖4）。

圖4 差異代謝物的富集分析Figure 4 Enrichment analysis of differential metabolites

對S1 vs S3鑒定出195種顯著差異代謝物進行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前20條主要涉及代謝途徑、次生代謝物的生物合成、花青素的生物合成和氨基酸的生物合成等（圖4）。

對S2 vs S3鑒定出186種顯著差異代謝成分進行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前20條主要涉及代謝途徑、異黃酮的生物合成、花青素的生物合成和氨基酸的生物合成等（圖4）。

3 討論與結論

果實成熟是葡萄最重要的生長發(fā)育過程之一。在此過程中，果實中的各種代謝產(chǎn)物會發(fā)生復雜的變化，其中糖、酸和多酚類物質(zhì)等的種類和含量變化與葡萄品質(zhì)有著密切的關聯(lián)[13]。在葡萄成熟過程中，最明顯的變化是果皮顏色。花色苷是重要的類黃酮物質(zhì)，是葡萄各個組織重要的呈色物質(zhì)。而在紅色品種果實顏色逐漸加深過程中花色苷持續(xù)積累，到成熟時基本穩(wěn)定在較高的含量水平[1]。本研究中，與轉色前4周相比，轉色前1周的‘品麗珠’葡萄果皮中氯化錦葵色素-3-葡糖苷、矮牽牛-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-對香豆酰)-5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷和甲基花青素-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷8種花青素的積累水平上升，說明在葡萄轉色之前已經(jīng)發(fā)生花色苷的積累。矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素O-丁香酸、花翠素3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-(6-對香豆酰)葡糖苷在轉色前4周和轉色前1周有相似的含量，到轉色前期含量上升。矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、甲基花青素-3,5-二葡糖糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷和二甲花翠素-3-(乙?；?葡糖苷9種花青素在轉色前4周和轉色前1周并沒有積累，在轉色前期才發(fā)生積累。Fasoli等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在‘赤霞珠’和‘黑比諾’果實中，錦葵色素3-O-葡糖苷含量從轉色前期到成熟期顯著上升。而本研究中‘品麗珠’果皮中錦葵色素3-O-葡糖苷的變化趨勢不同，可能是組織部位或品種不同原因導致的。

在葡萄果實成熟過程中，葉片通過積累、運輸、轉化光合產(chǎn)物以及果實自身的光合同化作用和有機酸代謝等過程使得果實中的糖類物質(zhì)不斷積累[13]。葡萄果實中積累的可溶性糖類物質(zhì)主要是葡萄糖和果糖，其次是蔗糖，后者含量不足總糖的4%。此外，還有少量的其他糖類，如：麥芽糖、半乳糖、水蘇糖、棉籽糖及蜜二糖等，隨著果實成熟含糖量逐漸增加[19-21]。此外，糖還可作為信號分子，與激素、N等信號形成網(wǎng)絡，通過交互作用調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[22-23]。本研究顯示，與轉色前4周相比，轉色前期‘品麗珠’葡萄果皮中的蔗糖和葡萄糖相對含量上調(diào)，與轉色前1周相比，轉色前期‘品麗珠 ’葡萄果皮中的蔗糖含量上調(diào)。轉色前4周、轉色前1周和轉色前期的‘品麗珠’葡萄果皮中可溶性糖類物質(zhì)積累以葡萄糖為主，蔗糖為輔，而沒有檢測到果糖的積累。Fasoli等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在‘赤霞珠’和‘黑比諾’果實中，果糖含量從轉色前期到成熟期顯著上調(diào)。而本研究中在‘品麗珠’葡萄果皮中并沒有檢測到果糖的積累，可能是由于組織或品種不同的原因。

葡萄果實中的酸包含無機酸和有機酸兩大類[24]。無機酸是葡萄根系從土壤中吸收，主要有硫酸、鹽酸、磷酸等。葡萄果實中有機酸的主要成分是酒石酸，還有蘋果酸以及少量的檸檬酸，其中酒石酸和蘋果酸占漿果總酸的90%左右，檸檬酸在葡萄果實中含量始終很低[13,15]。本研究中，與轉色前1周相比，轉色前4周‘品麗珠’葡萄的果皮中酒石酸的含量更高，后下降4～8倍，到轉色前期未檢測出酒石酸。蘋果酸在轉色前4周和轉色前1周有相似的含量，到轉色前期時含量下降2倍。而在3個采樣期的‘品麗珠’葡萄果皮中始終沒有檢測出檸檬酸。這說明葡萄果皮在幼果期酸含量較高，而在轉色期以后酸含量迅速降低。