表油菜素內(nèi)酯對(duì)熱脅迫下‘美樂(lè)’葡萄著色和抗氧化特性的影響

李嘉佳，王磊，曹玉早，王世平*

（1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2. 東海縣石梁河鎮(zhèn)金朵種植家庭農(nóng)場(chǎng)，江蘇連云港 222000）

溫度是影響植物新陳代謝等生理功能的主要因素之一，在適宜的溫度下，植物組織中的不同蛋白質(zhì)會(huì)堆疊成特定的形狀，行使不同功能[1]。極端的溫度變化會(huì)導(dǎo)致具有功能的蛋白質(zhì)變性失活，最終造成植物新陳代謝速率下降，果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)降低[2]。據(jù)報(bào)道，每年全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失有超過(guò)半數(shù)都是由極端溫度造成的， 隨著全球氣候的日益變暖，溫室效應(yīng)逐漸加劇，高溫對(duì)農(nóng)作物的危害更加嚴(yán)重[3]。因此，如何減輕極端氣候?qū)χ参锏膫Γ瑢?shí)現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培一直是學(xué)者們追求的目標(biāo)。

‘美樂(lè)’葡萄是世界范圍內(nèi)種植最廣泛的品種之一，具有早熟、多產(chǎn)、口感細(xì)膩等優(yōu)良性狀，可用來(lái)釀制美味而柔滑的葡萄酒，也可平衡其他葡萄酒的酸澀，極大提高葡萄酒的品質(zhì)，獲得更高的市場(chǎng)效應(yīng)[4-5]。但是‘美樂(lè)’耐熱性較差，夏季的高溫也成為制約其生長(zhǎng)發(fā)育最主要的環(huán)境因子，若長(zhǎng)期處于高溫環(huán)境下，會(huì)抑制樹(shù)體光合作用，延緩果皮著色，釀制的酒口感變劣，品質(zhì)變差，影響了該品種的的應(yīng)用[6]。噴施外源植物激素是快速提高植株抗逆性，緩解熱脅迫對(duì)細(xì)胞膜傷害的有效措施[7-8]。脫落酸（ABA）是促進(jìn)果皮著色和果實(shí)糖分積累的最重要的內(nèi)源植物激素。已有研究表明，向轉(zhuǎn)色前葡萄果實(shí)噴施一定濃度的ABA和乙烯類(lèi)物質(zhì)（乙烯利）可以顯著緩解高溫脅迫下葡萄果實(shí)的上色困難，固酸比下降等問(wèn)題[9-11]。油菜素內(nèi)酯（BR）具有在極低濃度下促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的功效，并且對(duì)果實(shí)膨大、糖分積累、果皮著色方面也有顯著的促進(jìn)作用[12]。但遺憾的是，對(duì)外源BR及24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）能否通過(guò)調(diào)控內(nèi)源BR的合成來(lái)緩解熱脅迫下‘美樂(lè)’葡萄上色困難，從而提高果實(shí)品質(zhì)方面還未有系統(tǒng)的研究，分子機(jī)制也仍待進(jìn)一步揭示。

本研究以盆栽?xún)赡晟摹罉?lè)’葡萄為試材，探究EBR對(duì)熱脅迫下果實(shí)次生代謝物合成及抗氧化能力的影響，著重聚焦EBR是否會(huì)通過(guò)影響內(nèi)源BR的合成來(lái)緩解熱脅迫下葡萄果皮上色困難的問(wèn)題，以期在未來(lái)葡萄栽培過(guò)程中通過(guò)轉(zhuǎn)色前果實(shí)浸泡EBR的方式來(lái)提高葡萄抗熱脅迫的能力，恢復(fù)受熱脅迫傷害的表型，進(jìn)而整體提高釀酒葡萄的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備及處理

2022年3月5日將兩年生‘美樂(lè)’植株移栽于10 L栽培容器中，挑選長(zhǎng)勢(shì)相近且無(wú)病蟲(chóng)害的植株，置于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院玻璃溫室中，栽培土壤由園土和蛭石按1∶1比例混合而成，土壤肥水和病蟲(chóng)害管理一致。待果實(shí)轉(zhuǎn)色前2周左右，挑選長(zhǎng)勢(shì)健壯的9株進(jìn)行試驗(yàn)，調(diào)整果穗數(shù)和葉片數(shù)，使總果粒數(shù)與總?cè)~片數(shù)比介于1.2～1.5，供后續(xù)處理。在果實(shí)轉(zhuǎn)色前1周，參考預(yù)備試驗(yàn)篩選的處理溫度，設(shè)置對(duì)照（Control，25 ℃/12 h，25 ℃/12 h），熱脅迫（HT，50 ℃/12 h，25 ℃/12 h）及熱脅迫 + EBR（HT+EBR，50 ℃/12 h，25 ℃/12 h）3組處理，不間斷處理14 d。每個(gè)處理使用3株冬季修剪完畢的盆栽葡萄，每株保留3～4穗果，每穗保留60粒，并定期澆灌霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。此外，EBR處理在首次高溫脅迫后6 h進(jìn)行，將未轉(zhuǎn)色的葡萄整穗果浸泡在2 L的0.5 mg·L-1EBR溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），每穗浸泡時(shí)間持續(xù)3 min，待果穗完全沒(méi)有EBR溶液滴落后，再重復(fù)該步驟一次。

1.2 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

本試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，分別為DAT0（處理后0 d，HT及EBR處理后6 h進(jìn)行采樣）、DAT3（處理后3 d，轉(zhuǎn)色前期）、DAT7（處理后7 d，轉(zhuǎn)色中期）、DAT11（處理后11 d，轉(zhuǎn)色完成）、DAT15（處理后15 d，成熟期）。在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)在每穗葡萄上中下部各采集3粒，每個(gè)處理采果數(shù)量不低于20粒。在測(cè)定完果實(shí)基本品質(zhì)指標(biāo)后（粒質(zhì)量、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、可溶性固形物、可滴定酸），所有果實(shí)經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)果實(shí)花色苷、酚類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物、抗氧化酶活性的測(cè)定及RNA的提取。

1.2.1 酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定

隨機(jī)選擇5粒完整果實(shí)，用液氮研磨成粉末后，稱(chēng)取0.10 g，加入1 mL pH 7.8的PBS緩沖液，4 ℃、12000 r·min-1下離心10 min，取上清液進(jìn)行果實(shí)類(lèi)黃酮、總酚、抗壞血酸、白藜蘆醇的測(cè)定，使用由北京索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 抗氧化酶活性的測(cè)定

取0.10 g凍干葡萄粉末于1 mL pH 7.8的PBS緩沖液中進(jìn)行冰浴勻漿處理，4 ℃、12000 r·min-1下離心10 min，取上清液進(jìn)行果實(shí)內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定，使用北京索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 總花色苷的測(cè)定

先將葡萄果實(shí)研磨成粉末，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10 g，加入6 mL含1%HCl的甲醇溶液，渦旋振蕩混勻2 min，4 ℃避光浸提過(guò)夜。在加入4 mL ddH2O后，將溶液在3800 r·min-1下離心10 min。收集上清液并加入1 mL氯仿，混勻，然后將混合物在13000 r·min-1下離心5 min。最后，使用分光光度計(jì)在530 nm和657 nm下分別測(cè)量水相中的花色苷含量，并使用等式 (A530－A657)·g-1得到總花色苷含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 內(nèi)源BR含量的測(cè)定

取0.50 g果肉組織粉末于5 mL pH 7.8的PBS緩沖液以及5 mL的1 mol Tris-HCl中進(jìn)行冰浴勻漿處理，經(jīng)過(guò)4 ℃、6000 r·min-1離心15 min 后，取上清液進(jìn)行果實(shí)內(nèi)BR含量的測(cè)定，使用上海研啟生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 qRT-PCR

RNA提取試劑盒（TaKaRa，大連，中國(guó)）用于提取在不同處理的不同采樣期的葡萄果實(shí)中的總RNA。BIO-RADXR凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)，加利福尼亞州，BIO-Rad）用于檢測(cè)提取的RNA的純度和完整性。使用CFX connect實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，CA，USA）進(jìn)行qRT-PCR，并遵循以下既定程序：95 ℃（20 s），然后95 ℃（39個(gè)循環(huán)，15 s），55 ℃（15 s），最后60 ℃（15 s）。基因的相對(duì)表達(dá)由2-△△Ct表示。所有基因和轉(zhuǎn)錄因子序列均從EnsemblPlants（http://plants.ensembl.org/info/about/index.html）獲得。 在Primer Premier 5.0和qPrimerDB qPCR引物數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的引物（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包（IBM，Armonk，NY，USA）對(duì)本研究中獲得的結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。方差齊性分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SE）形式，選擇單變量方差分析（one-way ANOVA，P＜0.05），每個(gè)處理至少選擇3組數(shù)據(jù)。所有圖形均使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software Inc.，圣地亞哥，美國(guó)），TBtools（CAN，CHN）和Visio 2020（Microsoft，SEA，美國(guó)）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理對(duì)熱脅迫下果實(shí)大小及著色的影響

圖1為熱脅迫及EBR處理對(duì)果粒表型及果粒大小的影響。結(jié)果表明，熱脅迫顯著抑制了果粒的膨大和著色，EBR處理后果粒大小和上色程度顯著改善，且果實(shí)縱橫徑、粒質(zhì)量均在轉(zhuǎn)色完成期和果實(shí)成熟期高于對(duì)照組（圖1A、B、C）。以上表型以及果粒大小指標(biāo)說(shuō)明，熱脅迫可以抑制‘美樂(lè)’葡萄的著色及膨大，EBR對(duì)恢復(fù)果實(shí)表型，促進(jìn)果實(shí)膨大有著積極效應(yīng)。

2.2 EBR處理對(duì)熱脅迫下果實(shí)品質(zhì)的影響

圖2為熱脅迫及EBR處理對(duì)果實(shí)糖積累、酸代謝和多種次生代謝產(chǎn)物合成的影響。具體來(lái)說(shuō)，熱脅迫顯著抑制了果實(shí)DAT3、DAT7、DAT11、DAT15時(shí)期的可溶性固形物的積累。在DAT3和DAT15時(shí)期，EBR浸泡果實(shí)后則顯著抑制了可溶性固形物在熱脅迫下的減少，但其值仍顯著低于對(duì)照組（圖2A）。此外，熱脅迫也可以顯著的降低葡萄果實(shí)內(nèi)可滴定酸的含量，EBR浸泡可恢復(fù)熱脅迫下其值的降低，但其含量仍顯著低于對(duì)照組（圖2B）。對(duì)于類(lèi)黃酮含量以及總酚含量（圖2C、2D），熱脅迫處理同樣顯著抑制了這兩種物質(zhì)的積累。在EBR處理組中，總酚含量和類(lèi)黃酮的含量較熱脅迫處理組顯著提升。此外，EBR對(duì)于緩解熱脅迫處理下抗壞血酸和白藜蘆醇這兩種次生代謝產(chǎn)物含量降低效果顯著，尤其在轉(zhuǎn)色期和成熟期（圖2E、2F）。

圖2 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)多種次生代謝物含量的影響Figure 2 Effect of EBR on the content of multiple secondary metabolites in 'Merlot' grape

2.3 EBR處理對(duì)熱脅迫下果實(shí)抗氧化能力的影響

如圖3所示，SOD、POD、CAT、PAL活性變化一致，呈現(xiàn)出總體先上升后下降的趨勢(shì)，熱脅迫顯著促進(jìn)了果實(shí)DAT0和DAT15時(shí)期SOD活性的提高，顯著促進(jìn)幾乎所有采樣時(shí)期POD和CAT的活性，而抑制了果實(shí)轉(zhuǎn)色期PAL的活性。此外，EBR在促進(jìn)熱脅迫下DAT3、DAT7和DAT11時(shí)期的SOD、POD以及所有采樣時(shí)期PAL的活性提高方面發(fā)揮著重要作用。此外，EBR較熱脅迫處理組顯著降低了熱脅迫下CAT活性。

圖3 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)抗氧化物質(zhì)積累的影響Figure 3 Effect of EBR on the accumulation of antioxidant substances in 'Merlot' grape fruit

進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上探究EBR對(duì)促進(jìn)熱脅迫下抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的作用，如圖4所示。SOD，POD、CAT和PAL1的表達(dá)總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，以及熱休克基因HSFA1、HSP70呈現(xiàn)出總體不斷下降的趨勢(shì)。在DAT7、DAT11和DAT15時(shí)期，熱脅迫顯著促進(jìn)了SOD、POD、CAT的表達(dá)，抑制了PAL1的表達(dá)。HSFA1和HSP70在DAT0和DAT15時(shí)期明顯上調(diào)，其余時(shí)間未見(jiàn)顯著差異，且EBR處理并不能促進(jìn)這些基因在熱脅迫下表達(dá)的顯著提高。

圖4 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)抗氧化物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響Figure 4 Effect of EBR on the expression of related genes of antioxidant substances in 'Merlot' grape fruit

2.4 EBR處理對(duì)熱脅迫下果實(shí)花色苷含量及其合成代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

如圖5A所示，隨著果實(shí)的不斷成熟，總花色苷含量不斷提高，熱脅迫處理在轉(zhuǎn)色期和成熟期時(shí)期均顯著抑制了總花色苷的積累，EBR有效地逆轉(zhuǎn)熱脅迫對(duì)花色苷積累的抑制作用。

圖5 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果皮花色苷含量及花色苷合成代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Figure 5 Effect of EBR on anthocyanin content, anthocyanin biosynthesis and metabolism, and signal transduction of 'Merlot' grape

進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上研究熱脅迫及EBR處理對(duì)‘美樂(lè)’葡萄花色苷合成代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，如圖5B所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花色苷合成的上游基因PAL、C4H、CHS、CHI變化趨勢(shì)較為一致，即隨著果實(shí)成熟，它們的表達(dá)量先增加后減少。隨著葡萄果實(shí)的不斷成熟，負(fù)責(zé)調(diào)控花色苷合成的下游基因的F3H不斷上調(diào)，下游基因LDOX和DFR先上調(diào)后下調(diào)。此外，在轉(zhuǎn)色期DAT15時(shí)期，熱脅迫較對(duì)照組降低了上述大部分基因的表達(dá)。而在DAT0后及DAT3時(shí)期，EBR對(duì)熱脅迫下這些基因表達(dá)量的上調(diào)起促進(jìn)作用。在大部分的采樣時(shí)間點(diǎn)，熱脅迫促進(jìn)了5GT的表達(dá)，而抑制了3GT的表達(dá)，EBR在顯著上調(diào)它們的表達(dá)方面做出貢獻(xiàn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)調(diào)控原花青素（兒茶素）合成的基因LAR呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，以及負(fù)責(zé)調(diào)控原花青素（表兒茶素）的基因ANR隨著果實(shí)的成熟呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，且在大多數(shù)采樣時(shí)間，熱脅迫處理均可以促進(jìn)它們的表達(dá)。經(jīng)過(guò)EBR浸泡果實(shí)后，DAT3時(shí)期的LAR、DAT7時(shí)期的ANR上調(diào)趨勢(shì)更顯著。此外，誘導(dǎo)二氫黃酮醇生成黃酮醇的基因FLS的表達(dá)量先上升后下降；在大部分采樣時(shí)間，熱脅迫處理顯著下調(diào)了它的表達(dá)量；在EBR浸泡果實(shí)后，表達(dá)量雖上調(diào)，但整體水平仍低于對(duì)照組。

對(duì)與花色苷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定（圖5C）。結(jié)果表明，MYB5A、MYB5B、mybA1、MYB14有一致的變化趨勢(shì)，呈現(xiàn)先上升后下降。在大多數(shù)的采樣時(shí)間點(diǎn)，熱脅迫下調(diào)了這些基因的表達(dá)，EBR則有效地逆轉(zhuǎn)了熱脅迫對(duì)它們表達(dá)的抑制作用，尤其是在DAT3和DAT7。

2.5 EBR處理對(duì)熱脅迫下果實(shí)內(nèi)源BR含量及其合成代謝的影響

如圖6所示，葡萄果實(shí)內(nèi)源BR含量隨著果實(shí)成熟而不斷增加，在DAT7和DAT15時(shí)期，熱脅迫顯著提高了內(nèi)源BR的含量。而在大部分的采樣點(diǎn)，EBR處理組相較于熱脅迫處理組，內(nèi)源BR含量無(wú)明顯提高，但其含量仍顯著高于對(duì)照組。

圖6 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)內(nèi)源BR含量的影響Figure 6 Effect of EBR on endogenous BR content of 'Merlot' grape

進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上分析熱脅迫和EBR對(duì)BR合成代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。如圖7所示，上游基因DWF4和CPD表現(xiàn)出較為一致的變化趨勢(shì)，在大多數(shù)采樣時(shí)間點(diǎn)，熱脅迫都顯著提高了它們的表達(dá)量，且在果實(shí)DAT11和DAT15時(shí)期，EBR對(duì)于上調(diào)這兩個(gè)基因表達(dá)量的作用效果也是顯著的。而B(niǎo)R合成上游基因DET2則表現(xiàn)出先略微下降，后逐步提升的趨勢(shì)。在大多數(shù)采樣點(diǎn)，熱脅迫下它的表達(dá)都顯著高于對(duì)照組，在果實(shí)DAT0和DAT11時(shí)期，EBR顯著上調(diào)它的表達(dá)。下游基因ROT3，BR6OX1，BR6OX2的表達(dá)量在熱脅迫處理組和EBR處理組的轉(zhuǎn)色期較對(duì)照組上調(diào)。調(diào)控BR代謝的BAS1會(huì)隨著果實(shí)不斷成熟先上調(diào)后下調(diào)，在大多數(shù)的采樣時(shí)間點(diǎn)，熱脅迫顯著上調(diào)了其表達(dá)，而EBR處理在絕大多數(shù)的采樣時(shí)期較對(duì)照組上調(diào)了它們的表達(dá)。

圖7 EBR對(duì)‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)內(nèi)源BR合成代謝的影響Figure 7 Effect of EBR on endogenous BR biosynthesis of 'Merlot' grape fruit

2.6 內(nèi)源BR的合成與緩解熱脅迫下果實(shí)品質(zhì)降低的關(guān)聯(lián)程度

通過(guò)相關(guān)性試驗(yàn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著‘美樂(lè)’葡萄果實(shí)的不斷發(fā)育成熟，內(nèi)源BR的積累與果實(shí)的膨大，糖分的積累和花色苷的富集關(guān)系最為密切（圖8）。令人意外的是，內(nèi)源BR的積累與多種抗氧化物質(zhì)的積累呈負(fù)相關(guān)，遂推測(cè)EBR緩解了熱脅迫對(duì)葡萄果實(shí)的傷害，提高其抗氧化能力并不是通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源BR合成這條途徑完成的，具體的驗(yàn)證仍待進(jìn)一步開(kāi)展。

圖8 內(nèi)源BR與品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)程度Figure 8 Correlation between endogenous BR and quality-related parameters

3 討論與結(jié)論

熱脅迫亦稱(chēng)高溫脅迫，是指環(huán)境溫度升高到植物適宜溫度以上，對(duì)植物的能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的脅迫現(xiàn)象[13]。隨著溫室效應(yīng)的日趨嚴(yán)重，熱脅迫是葡萄植株生長(zhǎng)發(fā)育面臨的最大問(wèn)題之一，輕則會(huì)導(dǎo)致植株的氧化受傷，代謝失調(diào)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)品質(zhì)[3]。綜合本試驗(yàn)結(jié)果可知，熱脅迫確實(shí)會(huì)顯著抑制釀酒葡萄‘美樂(lè)’的果實(shí)膨大、果皮著色、糖分積累、抗氧化酶活性提高。EBR的應(yīng)用可以通過(guò)促進(jìn)與花色苷合成密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，減輕熱脅迫造成的果皮著色困難的程度，通過(guò)上調(diào)部分抗氧化基因的表達(dá)量，緩解熱脅迫對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害，提高抗氧化能力。此外，EBR促進(jìn)果實(shí)內(nèi)源BR的積累，上調(diào)負(fù)責(zé)內(nèi)源BR合成的大部分下游基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)葡萄果實(shí)代謝失衡、品質(zhì)下降的現(xiàn)象。最后，相關(guān)性分析進(jìn)一步佐證了我們的推測(cè)：BR與葡萄果實(shí)多種次生代謝產(chǎn)物的合成密切相關(guān)，尤其體現(xiàn)在果實(shí)膨大、果皮著色與糖分積累方面。

首先，高溫主要引起生物膜的物理化學(xué)狀態(tài)和蛋白質(zhì)分子構(gòu)型的可逆變化，由于類(lèi)囊體膜對(duì)熱特別敏感，光合作用失調(diào)是熱脅迫的最初指標(biāo)[14]。高溫造成植物光合作用受到抑制，最后導(dǎo)致細(xì)胞和個(gè)體的死亡[15]。前人研究證實(shí)，EBR處理葡萄葉片后，受熱脅迫（42 ℃）損害嚴(yán)重的葉片表型慢慢恢復(fù)，光合速率提高，并伴隨著抗氧化相關(guān)的SOD、POD、CAT等物質(zhì)含量的增加，植株對(duì)抗熱脅迫的能力顯著增強(qiáng)[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，熱脅迫處理下果實(shí)內(nèi)的多種次生代謝產(chǎn)物（類(lèi)黃酮、總酚、白藜蘆醇）含量顯著降低，果實(shí)內(nèi)與抗逆能力相關(guān)的SOD、POD及CAT含量在一定時(shí)期內(nèi)顯著增加，果實(shí)清除自由基的能力相應(yīng)提高。EBR對(duì)于減輕果實(shí)品質(zhì)下降及抗氧化能力提高方面發(fā)揮著重要作用，在果實(shí)轉(zhuǎn)色期和成熟期，EBR顯著促進(jìn)了熱脅迫下可溶性固性物的積累。在轉(zhuǎn)色完成和成熟期，EBR減輕了熱脅迫果實(shí)內(nèi)抗壞血酸和白藜蘆醇減少的表型。在大部分采樣時(shí)期，EBR進(jìn)一步促進(jìn)了葡萄果實(shí)內(nèi)SOD和POD的積累。此外，我們發(fā)現(xiàn)EBR對(duì)促進(jìn)總酚以及類(lèi)黃酮的積累在轉(zhuǎn)色期和成熟期較明顯。基于此，推測(cè)熱脅迫處理加速了轉(zhuǎn)色期和成熟期‘美樂(lè)’葡萄膜脂過(guò)氧化，且與清除自由基相關(guān)的抗氧化酶活性也相應(yīng)提高。EBR不僅促進(jìn)了多種反映果實(shí)品質(zhì)的次生代謝產(chǎn)物的合成，而且更進(jìn)一步的加速了多種抗氧化物質(zhì)的富集，雖然與抗氧化能力提高有關(guān)基因的表達(dá)量較熱脅迫處理組沒(méi)有明顯的上調(diào)，但熱脅迫對(duì)果實(shí)表型及品質(zhì)的損害還是在EBR處理下有所減輕。

其次，高溫必然會(huì)引起植物內(nèi)源激素含量的變化[17]，諸如脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）這兩種已被廣泛報(bào)道與抗逆性提高相關(guān)的植物激素，它們的含量在經(jīng)過(guò)熱脅迫后會(huì)顯著提高[18-20]。而與植株生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的生長(zhǎng)素（IAA）和細(xì)胞分裂素（CTK）在經(jīng)過(guò)熱脅迫后會(huì)顯著降低[21-22]。雖然BR也被證實(shí)與提高植株抗逆性密切相關(guān)，但由于BR在果實(shí)內(nèi)含量極低，很少有研究系統(tǒng)地討論EBR對(duì)熱脅迫處理后葡萄內(nèi)源BR含量變化的影響。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了熱脅迫處理的確可以顯著提高大部分采樣時(shí)期果實(shí)內(nèi)源BR的含量。EBR處理過(guò)后，在轉(zhuǎn)色前期和成熟期，內(nèi)源BR含量較熱脅迫處理組提高，但兩個(gè)處理組并沒(méi)有顯著的差異。進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上研究熱脅迫和EBR處理對(duì)內(nèi)源BR合成代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn)，熱脅迫促進(jìn)了BR合成最關(guān)鍵的兩個(gè)下游基因（BR6OX1與BR6XO2）在轉(zhuǎn)色完成和成熟期的表達(dá)，且促進(jìn)了BR代謝相關(guān)基因（BAS1）表達(dá)量在大部分采樣時(shí)期的上調(diào)，推測(cè)雖然BR合成和分解的速率在經(jīng)過(guò)熱脅迫后都有了提高，但是整體上BR合成的速率還是要快于BR分解的速率，最終導(dǎo)致熱脅迫促進(jìn)葡萄成熟期果實(shí)內(nèi)源BR積累的表型。

眾所周知，葡萄果皮著色困難是熱脅迫后最明顯的表型之一，持續(xù)高溫會(huì)嚴(yán)重阻礙多種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，從而造成果皮花色苷含量的減少[23-25]。本研究結(jié)果不僅從表型上提供了熱脅迫嚴(yán)重阻礙‘美樂(lè)’葡萄果皮著色的理論依據(jù)，而且也得出了經(jīng)過(guò)熱脅迫后，果皮花色苷在轉(zhuǎn)色期和成熟期顯著降低的結(jié)論，并且在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)一步解釋了這個(gè)現(xiàn)象，即在果實(shí)轉(zhuǎn)色期和成熟期，熱脅迫顯著抑制了花青素合成下游基因3GT的表達(dá)，而促進(jìn)了原花青素合成關(guān)鍵基因ANR和LAR的表達(dá)，EBR的應(yīng)用則可以有效緩解大部分時(shí)期熱脅迫對(duì)葡萄著色的抑制作用。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，熱脅迫會(huì)更傾向促進(jìn)原花青素的合成，而抑制與果皮著色有關(guān)的花青素的合成，最終產(chǎn)生相較對(duì)照組著色不良的表型，而EBR則可以通過(guò)上調(diào)大部分與花青素合成相關(guān)的基因來(lái)緩解熱脅迫處理造成果皮著色困難的現(xiàn)象。

綜上所述，本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)色前對(duì)釀酒葡萄‘美樂(lè)’實(shí)施熱脅迫處理（最高54 ℃，最低46 ℃，平均50 ℃）基礎(chǔ)上，并于當(dāng)天用EBR浸泡葡萄果穗，發(fā)現(xiàn)熱脅迫顯著抑制葡萄膨大、糖分積累、果皮著色及多種抗氧化酶活性增強(qiáng)。EBR處理整體上通過(guò)促進(jìn)多種次生代謝產(chǎn)物的積累緩解了熱脅迫對(duì)葡萄著色的抑制，通過(guò)提高幾種抗氧化酶的活性減輕熱脅迫對(duì)葡萄果實(shí)細(xì)胞膜的傷害。此外，我們推測(cè)EBR可通過(guò)調(diào)控內(nèi)源BR的合成促進(jìn)果皮糖及花色苷的積累，改善熱脅迫下果皮著色困難的情況，但具體的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。